ДЛЯ ГОСОВ / Биотех-ГАК-12 / 11.2. рек-белки

11. 2. При промышленном получении рекомбинантных белков выбор микроорганизма-продуцента зависит от многих факторов. Определите критерии отбора микроорганизма.

Успехи генетической инженерии привели к тому, что свыше 100 белков человека (биорегуляторов, корректоров гомеостаза, факторов врожденного и приобретенного иммунитета) могут быть получены биотехнологическим способом.

При этом технология рекомбинантной ДНК позволяет их совершенствовать: повышать физиологическую активность, снижать вероятность побочных реакций после введения и т.д.

При выборе микроорганизма (как продуцента чужеродного белка предполагаемого лекарственного препарата) необходимо:

наиболее полно изучить геном;

подробно исследовать метаболизм на уровне вида;

использовать непатогенные микроорганизмы

использовать микроорганизмы, способные расти в производственных условиях на экономически доступных средах.

Избранные в качестве предполагаемых продуцентов микроорганизмы оцениваются и изучаются уже на уровне конкретных штаммов. При необходимости штаммы-биообъекты (как носители чужеродного генетического материала и продуценты чужеродного белка) могут быть усовершенствованы методами генетической инженерии, что позволяет свести к минимуму вероятность протеолиза чужеродных белков, гидролиза чужеродной информационной РНК и «исключения» чужеродных генов из генома.

Иногда чужеродный белок может откладываться в клетке продуцента в виде белковых гранул (в недоступной для протеаз форме), что характерно, например, для Е. coli.

Особое внимание привлекает проблема секреции чужеродных белков, так как выделение целевого белка в высокоочищенном виде из культуральной жидкости - задача гораздо более легкая, чем выделение его из клетки. Как известно, секретируемые белки отличаются от несекретируемых тем, что имеют на N-конце так называемую лидерную последовательность аминокислотных остатков, которая способствует переносу их через мембрану клетки в среду. Иногда конструируются гибридные опероны с общим промотором, включающие ген чужеродного белка и ген секретируемого белка, лидерная последовательность которого извлекает из клетки чужеродный белок. Можно использовать гибридные белки для облегчения очистки (например, использование аффинного сорбента для -галактозидазы). Далее два белка разделяются принятыми химическими или ферментативными методами.

Нельзя не отметить, что продуценты чужеродного белка не отличаются высокой способностью к выживанию в природных условиях.

В качестве продуцентов рекомбинантных белков человека в настоящее время используются: Escherichia coli (кишечная палочка), Bacillus subtilis (сенная палочка), Saccharomyces cerevisiae (пекарские дрожжи). Эти организмы достаточно безопасны, однако попадание их (как продуцентов того или иного человеческого белка) в окружающую среду по ряду причин нежелательно. В связи с этим существуют принятые и тщательно соблюдаемые правила работы с рекомбинантами. Безопасность должна соблюдаться на генетическом и на физическом уровнях.

Меры безопасности принимаются и на физическом уровне: на всех местах выброса газа устанавливают микробиологические фильтры. По завершении рабочего цикла без разъединения системы, что может привести к понижению давления во всех емкостях, где могут оказаться клетки рекомбинанта, так как вследствие нарушения герметизации воздух вместе с чужеродными клетками будет втягиваться в систему, оборудование стерилизуют. И последнее - на производстве должны соблюдаться все требования «Правил организации производства и контроля качества лекарственных средств» (GMP).