БИОЭНЕРГЕТИКА / Биология / Молекулная биология клетки 3-Албертс-1994

81

16.2.8. Будущая специализация клеток определяется задолго до появления внешних признаков дифференцировки

[14, 22]

Наиболее известное доказательство существования клеточной памятистойкое сохранение дифференцированного состояния клеток во взрослом организме (см. разд. 13.4.1). Благодаря клеточной памяти стимул, направивший клетку на тот или иной путь дифференцировки, может оказывать свое действие на ее потомков. Некоторые клетки сомитов позвоночных специализируются как предшественники мышечных клеток на очень ранних стадиях развития и мигрируют из сомитов в различные части тела, в том числе в области формирования конечностей; все это сложное поведение определяется серией решений, принятых клетками значительно раньше, а именно до и во время гаструляции (см. разд. 16.6.5). Эти клетки-предшественники еще не содержат большого количества сократительных белков, характерных для зрелых мышечных волокон; они даже внешне не отличаются от других клеток зачатка конечности, имеющих иное происхождение. Только через несколько дней они приобретают внешние признаки, характерные для дифференцированных мышечных клеток и начинают интенсивно синтезировать специфические для этих клеток белки. Остальные клетки будущей конечности, расположенные здесь же, дифференцируются в элементы соединительной ткани. Следовательно, выбор программы развития (т.е. станет ли клетка мышечной или клеткой соединительной ткани) происходит задолго до того, как проявляются внешние признаки дифференцировки. Вероятно, эта программа записана в клетках в виде трудно уловимых химических модификаций (в данном случае, по-видимому, происходит активация первичного специфического для мышиных клеток регуляторного гена - см. разд. 10.1.8).

Детерминированными называют клетки, которые выбрали программу развития. В эмбриологии «детерминация»-настолько важное и тонкое понятие, что мы должны дать ему более строгое определение. Клетку считают детерминированной, если в ней произошло стойкое внутреннее изменение, которое делает ее и ее потомков отличными от других клеток эмбриона и предопределяет развитие по специализированному пути.

Рассмотрим некоторые пункты этого определения.

1.Изменение должно сделать клетку и ее потомков отличными от других клеток и направить эти клетки по определенному пути развития: клетка не считается детерминированной только потому, что обгоняет другие клетки в процессе своего созревания. Детерминация включает выбор определенного пути развития.

2.Изменения, происходящие в дифференцирующихся клетках, должны быть самоподдерживающимися. Детерминация подразумевает установление различий, наследуемых в ряду поколений клеток. Клетка не считается детерминированной только на том основании, что она занимает определенное положение в теле животного. Чтобы быть таковой, она должна сохранить свои характерные особенности при исчезновении внешних сигналов, вызвавших появление этих особенностей.

Детерминация иногда определяется, как необратимое изменение. Но поскольку мы не в состоянии проверить поведение клетки во всех возможных условиях окружающей среды, нельзя полностью исключить обратимость такого изменения; более того, в некоторых случаях клеточная память может быть нарушена, и тогда детерминированное состояние станет обратимым. Поэтому мы стремимся избегать крайних выражений и говорим о детерминации, как о самоподдерживающемся изменении свойств клеток.

82

Термин дифференцировка используется обычно для определения явно выраженной специализации, т.е. для определения клеточных свойств, которые ярко выражены. Обычно клетка становится детерминированной до дифференцировки, хотя в некоторых случаях оба процесса осуществляются одновременно. Однако в принципе дифференцировка может осуществляться без детерминации, если явная специализация клетки носит обратимый характер.

16.2.9. Время детерминации клеток можно определять в экспериментах с пересадками [23]

Для доказательства того, что клетка или группа клеток детерминированы, следует выделить у них определенный признак, сохраняющийся даже при экспериментальном изменении условий, в которых он возник. В этом случае обычно используют трансплантацию клетки или клеток, перенося их в необычные условия.

Простейший эксперимент такого рода был проведен на эмбрионах амфибий. Ранее мы уже упоминали, что можно построить карту презумптивных зачатков бластулы или гаструлы, содержащую подробные указания о том, какие органы взрослого организма разовьются из тех или иных областей зародыша. Легко проследить, что при нормальном ходе развития клетки одной области дадут начало эпидермису, а клетки другой - мозгу. Для получения ответа на наш вопрос необходимо поменять местами два кусочка эмбриональной ткани, вырезанные из разных областей, например так, чтобы часть будущего (презумптивного) эпидермиса оказалась на месте будущего мозга и наоборот. Если в момент трансплантации клетки уже детерминированы, то они будут развиваться автономно в соответствии со своим прежним положением, т.е. клетки из области презумптивного эпидермиса, будучи перенесены в область, из которой должен образоваться мозг, образуют эпидермис, а клетки из области будущего мозга после трансплантации в область, дающую начало эпидермису, образуют нервную ткань. Заметим, однако, что на стадии ранней гаструлы клетки еще «не помнят» своего происхождения и дифференцируются в соответствии со своим новым положением. Но если провести такой же эксперимент несколько позже (например, на стадии поздней гаструлы), то клетки презумптивного мозга в области эпидермиса будут дифференцироваться в нервную ткань, а клетки презумптивного эпидермиса, пересаженные в область будущего мозга, - в эпидермис. Следовательно, обе группы клеток стали детерминированными в какой-то момент между ранней и поздней гаструлой.

16.2.10. Состояние детерминации может определяться цитоплазмой или хромосомами [24, 25]

Клеточная память представляет собой одну из наиболее интригующих проблем молекулярной биологии: от чего зависит самоподдерживание определенного характера экспрессии генов? Подробное обсуждение этого вопроса с биохимической точки зрения вы найдете в гл. 10. Здесь же для дальнейшего обсуждения полезно разделить молекулярные механизмы на два класса, которые можно обозначить как

цитоплазматические и ядерные.

Когда мы говорим о цитоплазматической памяти, мы подразумеваем, что компоненты, кодируемые определенным набором генов, присутствуют в цитоплазме (либо во внеклеточном окружении) и оказывают прямое или косвенное действие на геном по принципу обратной связи, поддерживая избирательную экспрессию определенного набора генов;

83

в цитоплазме клеток разных типов содержатся различные контролирующие факторы. Таким образом, при получении ядра из дифференцированных клеток одного типа и инъекции этого ядра в цитоплазму клеток другого типа характер экспрессии генов должен измениться с тем, чтобы соответствовать цитоплазме хозяина. В экспериментах по ядерным пересадкам на яйцеклетках амфибий (см. разд. 16.2.1), равно как и в других экспериментах по искусственному слиянию клеток, были получены данные, свидетельствующие о том, что именно так все и происходит. Это позволяет говорить о важной роли механизмов, обеспечивающих цитоплазматическую память.

Вместе с тем ядерная память, известная также как геномный импринтинг, определяется самоподдерживающимися изменениями, которые обусловлены изменениями свойств хромосом. В ходе этих изменений последовательность нуклеотидов в ДНК остается постоянной, но происходит выбор генов, которые будут экспрессироваться. Наиболее хорошо изучены примеры ядерной памяти, связанные с метилированием ДНК: как объясняется в разд. 10.3.16, существующий характер метилирования цитозинов в ДНК может сохраняться в ряду клеточных поколений и это свойство определяется действием фермента метилазы.

Эмбриональное развитие является как бы экспериментом природы, поставленным ею для изучения ядерной памяти. Спермий и неоплодотворенная яйцеклетка существенно различаются по состоянию клеточной дифференцировки, и тем не менее они содержат практически идентичный набор генов и после оплодотворения их хромосомы объединяются в одной клетке. Сохраняются ли функциональные различия хромосом, происходящих из спермия и яйцеклетки, после их объединения в зиготе? В исследованиях на мышах на этот вопрос был получен положительный ответ.

16.2.11. Наборы хромосом, происходящие из спермия и яйца, несут отпечаток своей истории [25]

Как уже упоминалось, неоплодотворенное яйцо можно стимулировать к дроблению без помощи спермия: независимо от того, происходит активация спонтанно или вызвана искусственно, ее результатом является партеногенетический эмбрион (см. разд. 16.2.6). У животных определенных видов, в том числе и позвоночных (например, у некоторых ящериц), такой эмбрион способен развиться в нормальное здоровое взрослое животное. У млекопитающих партеногенетические эмбрионы погибают на ранних стадиях развития; у этих животных до сих пор неизвестны случаи развития без оплодотворения, несмотря на большой интерес к данной проблеме и многочисленные попытки экспериментаторов. Причина этих неудач была выявлена в экспериментах на яйцеклетке мыши.

Известно, что оплодотворенное яйцо (зигота) содержит два пронуклеуса, один из которых получен от отца, а второй - от матери. Используя микропипетку, можно извлечь один из пронуклеусов и заменить его пронуклеусом другого яйца (рис. 16-28). Таким образом мы создаем зиготу, содержащую либо два материнских, либо два отцовских пронуклеуса. В любом случае геном будет одним и тем же (если принять, что отцовский пронуклеус содержал не Y-, а Х-хромосому). Оказалось, что зигота с двумя отцовскими пронуклеусами образует эмбрион, у которого нет структур, развивающихся в норме из внутренней клеточной массы, а зигота с двумя материнскими пронуклеусами образует эмбрион, не содержащий структур, возникающих из трофэктодермы. Так как оба типа зигот обладают одинаковой цитоплазмой, эти эксперименты убедительно свидетельствуют о том, что ядерная

84

Рис. 16-28. Метод трансплантации пронуклеусов позволяет получать яйцеклетки, оба пронуклеуса которых принадлежат самцу (или самке). Слияние мембран происходит в результате воздействия частично инактивированного вируса Сендай, инъецированного на третьем этапе одновременно с трансплантацией пронуклеуса.

память обусловливает экспрессию различных наборов генов в материнских и отцовских хромосомах; иными словами, одни гены экспрессируются только тогда, когда они наследуются от отца, а другие - когда наследуются от матери.

Наблюдения на трансгенных мышах показали, что в основе явления геномного импринтинга лежит метилирование ДНК. Например, можно скрестить трансгенных мышей, несущих последовательности чужеродной ДНК, и получить потомство, наследующее внедрившуюся чужеродную последовательность только от отца или только от матери. У таких мышей интегрированные последовательности могут метилироваться по-разному в зависимости от происхождения из спермия или яйцеклетки. Характер метилирования сохраняется в соматических тканях в течение всей жизни взрослого животного, но может измениться в процессе формирования клетками зародышевой линии следующего поколения гамет. Характер экспрессии одного из генов, о котором известно, что он ведет себя подобным образом, определяется метилированием; если ген наследуется от матери, он метилирован и не экспрессируется у данного животного, тогда как тот же ген, унаследованный от отца, не метилирован и экспрессируется.

Заключение

В процессе развития из оплодотворенной яйцеклетки возникает множество клеток различных типов. За редким исключением геномы дифференцированных клеток сохраняются в неизменном состоянии, изменяется лишь характер экспрессии генов. Различия, возникающие между клетками, могут быть следствием неравного распределения цитоплазматических детерминантов в яйцеклетке до начала деления или следствием последовательного изменения клеточного окружения в эмбрионе. Например, у Xenopus бластомеры анимального и вегетативного полушарий наследуют различные цитоплазматические детерминанты. Бластомеры вегетативного полушария индуцируют анимальные бластомеры к развитию по мезодермальному пути; в отсутствие такого воздействия анимальные бластомеры дают начало эктодерме. Индукция опосредуется сигнальными молекулами (ФРФ и ТФ-β2 или их аналогами), которые в организме взрослых животных участвуют в регуляции роста и дифференцировки клеток.

Яйцеклетки млекопитающих обладают уникальными свойствами, являясь, по сути дела, симметричными. Благодаря этому свойству все бластомеры млекопитающих исходно не отличаются друг от друга; различия возникают как следствие межклеточных взаимодействий. По этой же причине клетки двух различных эмбрионов, объединенные в одно целое, способны скорректировать программу развития и сформировать

85

химерную мышь. В отсутствие нормального влияния соседних клеток бластомеры раннего зародыша мыши могут, развиваться аномально, образуя тератокарциномы, используемые для получения эмбриональных стволовых клеток. При имплантации нормальным ранним эмбрионам такие клетки восстанавливают нормальное поведение, их потомки дифференцируются в зависимости от окружения и способны участвовать в формировании нормального эмбриона.

В процессе развития эмбриональные клетки приобретают определенные различия, которые они должны сохранить даже после исчезновения воздействия, вызвавшего такую диверсификацию клеток. Для этого необходимо, чтобы клетки обладали памятью, обеспечивающей детерминацию клеток в направлении определенной специализации задолго до проявления внешних признаков дифференцировки. Механизмы клеточной памяти могут быть либо цитоплазматическими, определяемыми как воздействие молекул цитоплазмы на ядро с целью поддержания собственного синтеза, либо ядерными, основанными на модификации хроматина, например метилировании ДНК.

16.3. Программы развития индивидуальных клеток: анализ генеалогии клеток на примере нематод [26]

Клетки, обладая памятью подобно компьютерам, способны реализовать сложные программы развития; в результате реализации таких программ из множества клеток, каждая из которых действует по своей собственной программе, контролируемой в процессе развития, возникает сложное тело взрослого животного. Некоторые типы поведения клеток в процессе развития достаточно автономны, а другие определяются сигналами, идущими от окружающих клеток. Таким образом, клетки эмбриона можно уподобить сети компьютеров, действующих параллельно и обменивающихся информацией. Каждая клетка обладает одинаковым геномом, т.е. содержит одну и ту же программу, но эта программа может существовать во множестве вариантов, направляющих развитие по разным путям в зависимости от сигналов, воспринимаемых клеткой из окружающей среды.

Клеточная память играет чрезвычайно важную роль, и именно по этой причине поведение клеток в определенное время зависит от того выбора, что был сделан ее предками в предыдущих циклах деления. Таким образом, для полного понимания всей программы развития необходимо знать, как осуществлялись клеточные деления, т.е. необходимо знать генеалогию индивидуальных клеток эмбриона. В этом и состоит сущность генеалогического анализа, проведение которого, особенно на примере крупных и сложно организованных животных (например, позвоночных), представляет собой довольно трудную задачу. Если на ранних стадиях развития специфически пометить отдельные клетки, то на более поздних стадиях можно идентифицировать сами клетки или их потомки. Один из способов мечения заключается в микроинъекции специфических молекул, за которыми легко следить (например, флуоресцирующие красители или фермент пероксидазу хрена; см. разд.. 19.1.5), в клетки ранних эмбрионов (рис. 16-29). Кроме того, отдельные клетки эмбриона можно пометить генетически, например, создавая условия для их инфекции специально выбранным ретро-вирусом (см. разд. 17.5.4) или подвергая эмбрионы действию ионизирующего излучения, вызывающего случайные соматические мутации (см. разд. 16.5.13). Эти методы генеалогического анализа весьма трудоемки и каждый из экспериментов дает лишь небольшую информацию

86

Рис. 16-29. Прослеживание клеточной родословной у асцидии Halocynthia roretzi. А. Эмбрион на стадии 64 клеток. На этой стадии в один из бластомеров инъецируют в качестве метки пероксидазу хрена. В результате становится возможным идентифицировать потомки этого бластомера, подобно тому, как это сделано на рисунке под фотографией. Б. Личинки, развивающиеся из 6 таких эмбрионов, были подвергнуты специальной обработке для выявления фермента (показано черным цветом) в клетках - потомках инъецированных бластомеров. У двух личинок, изображенных слева (вверху и внизу), предковым бластомером, в который вводилась метка, был верхний из показанных красным цветом на рис. А, у двух личинок, изображенных посередине, нижний из этих бластомеров; для двух личинок, изображенных справа, предковый бластомер на рис. А не виден. У данного вида в процессе развития из одних и тех же бластомеров всегда возникают определенные части зародыша (см. фотографии). (Н. Nishida, Dev. Biol., 121, 526-541, 1987.)

о потомках эмбриональных клеток. Ситуация осложняется еще и тем, что у позвоночных и многих других организмов наследственность подвержена случайной изменчивости даже у генетически идентичных животных.

Однако у представителей некоторых низших типов, в том числе у моллюсков, кольчатых и круглых червей, деление и перемещение клеток в высшей степени упорядочены и у всех особей осуществляются одинаково. Столь полная воспроизводимость результатов была использована при изучении крошечной прозрачной нематоды Caenorhabditis elegans. Это животное характеризуется простым и практически неизменным строением, и его развитие можно проследить клетка за клеткой на всем пути от яйца до взрослого организма. Здесь можно вычертить полную генеалогию каждой клетки. На этом фоне удается очень точно отметить эффекты мутаций и иных экспериментальных воздействий. Такой метод позволяет связать определенные гены с конкретными этапами в реализации программ, контролирующих развитие клеток. Однако мы увидим, что изучение внутренней логики программы отнюдь не простая задача, даже в таких благоприятных условиях; ее сложность во многом обусловлена наличием межклеточных взаимодействий. Мы закончим этот раздел примером, иллюстрирующим применение экспериментов в культуре для непосредственного анализа небольших фрагментов программы, контролирующей развитие отдельных клеток млекопитающих.

16.3.1. В анатомическом и генетическом отношениях нематода Caenorhabditis elegans устроена очень просто [27]

Длина взрослой особи С. elegans около 1 мм. Тело червя состоит приблизительно из 1000 соматических клеток и 1000-2000 половых клеток (рис. 16-30). С помощью электронной микроскопии серийных срезов удалось полностью, клетка за клеткой, реконструировать анатомию животного. Общий план строения этого примитивного червя в основных чертах такой же, как и у большинства высших животных. Удлиненное тело обладает билатеральной симметрией и состоит из обычных тканей (нервы, мышцы, кишечник, кожа), организованных обычным способом (рот и мозг на переднем конце тела, анальное отверстие на заднем). Наружная стенка тела состоит из двух слоев - защитной гиподермы («кожи») и подстилающего ее мышечного слоя. Простая трубка, образованная клетками энтодермы, формирует кишечник. Между кишечником и стенкой тела расположена вторая трубка (гонада), построенная из соматических клеток и содержащая половые клетки. Взрослые особи С. elegans представлены двумя формами - гер-

87

Рис. 16-30. Взрослая гермафродитная особь Caenorhabditis elegans (вид сбоку). (J. Е. Sulston, H. R. Horvitz, Dev. Biol., 56, 110-156, 1977.)

мафродитами и самцами. Для простоты гермафродитов можно рассматривать как самок, образующих ограниченное количество спермы: самка может воспроизводиться либо путем самооплодотворения своей собственной спермой, либо путем перекрестного оплодотворения гермафродита самцом при спаривании. При самооплодотворении в основном возникают гомозиготные потомки, что превращает С. elegans в исключительно удачный объект для проведения генетических исследований.

Сравнительной простоте анатомии С. elegans соответствует такая же простота генетического аппарата. В 6 парах гомологичных хромосом содержится, по-видимому, всего лишь около 3000 жизненно важных генов. Гаплоидный геном содержит 80 х 106 пар нуклеотидов, что примерно в 17 раз больше, чем у Е. coli и в 38 раз меньше, чем у человека. В настоящее время с помощью мутационного анализа идентифицировано примерно 800 генов. Среди них гены, влияющие на такие признаки, как форма и поведение червей, гены, кодирующие такие известные белки, как миозин, и гены, контролирующие характер и направление развития. Кроме того, получена библиотека генома в виде большого набора перекрывающихся фрагментов ДНК (см. разд. 5.6.3).

16.3.2. Для развития нематод характерно удивительное постоянство [28]

Развитие С. elegans начинается с одной клетки - оплодотворенного яйца, которое последовательно делится; на стадии 558 клеток под яйцевой оболочкой формируется маленький червячок. После вылупления клеточные деления продолжаются, что приводит к дальнейшему росту и половому созреванию червя, который проходит 4 последовательные личиночные стадии, разделенные линьками. В результате последней линьки образуется взрослая особь - червь-гермафродит, начинающий откладывать собственные яйца. Полный цикл развития от яйца до яйца занимает около 3 суток.

Тело червя прозрачно, поэтому здесь можно прижизненно наблюдать деление, миграцию и дифференцировку клеток (рис. 16-31), а также описать генеалогические отношения и поведение всех клеток, начиная со стадии одноклеточного яйца и кончая взрослым животным. Эти исследования показали, что соматические структуры животного образуются по одной неизменной генеалогической схеме. Каждое из множества клеточных делений происходит в строго определенное время. Это означает, что каждая клетка-предшественница и все ее потомки делятся у всех особей одинаково (за несколькими исключениями). Вот почему,

89

Рис. 16-32. Родословная клеток, формирующих кишечник С. elegans. Яйцо (вверху) изображено в том же масштабе, что и взрослая особь (внизу). Следует отметить, что клетки кишечника образуют только один клон (как и клетки зародышевой линии), тогда как в большинстве других тканей клетки могут давать начало нескольким клонам.

в нейрон или в мышечную клетку, стать предшественницей той или этой ветви генеалогического древа. Чтобы понять механизм такого выбора необходимо идентифицировать соответствующие гены. Мутации в этих генах обусловливают нарушение развития, но это не единственный вид мутаций, приводящих к подобным последствиям. Так, некоторые мутации жизненно важных генов могут «укоротить» родословное древо, вызвав преждевременную гибель эмбриона. Мутации в генах, определяющих синтез специализированных белков, приводят к тому, что при внешне нормальном строении тела некоторые типы дифференцированных клеток будут функционировать аномально. В отличие от всех вышеперечисленных случаев мутации генов, затрагивающих выбор программ развития, приводят к нарушению общего плана строения тела: в результате нормальные дифференцированные клетки будут располагаться в организме аномально. Нарушение генеалогического древа может выражаться и в появлении аномального количества определенных клеток. Все перечисленные типы мутаций позволяют идентифицировать гены,

контролирующие развитие (рис. 16-33).

Мутации некоторых контролирующих генов приводят к замене одного типа клеток другим на последних этапах реализации программы развития. В данных случаях происходит изменение выбора, сделанного на более ранних стадиях, так что одна ветвь древа полностью замещается другой. Как показано на рис. 16-34, определенный тип развития может воспроизводиться с высокой частотой на нескольких независимых ветвях родословного древа. Такой феномен предполагает существование некой стандартной схемы, реализуемой в различных условиях. В целом возникает ощущение, что каждая из ветвей генеалогического древа контролируется сложной комбинацией генов,