Определение компонентов препарата "бициллин-3" методом вэжх
Бициллин-3 является пенициллином пролонгированного действия и представляет собой смесь натриевой, новокаиновой и бензатиновой солей бензилпенициллина (БП). По действующей ВФС 42-3034—98 определение БП в препарате проводят с помощью ВЭЖХ, новокаин определяют спектрофотометрически, а бензатин (N,N1-дибензилэтилендиамин) экстрагируют эфиром из водного раствора, насыщенного хлоридом натрия. После выпаривания эфира бензатин определяют титрованием хлорной кислотой.
В Европейской Фармакопее содержание БП и бензатина в бензатиновой соли БП определяют с помощью градиентной ВЭЖХ в смеси метанола с раствором фосфата натрия при рН 3,5.
Цель работы — разработка метода ВЭЖХ в изократическом режиме для определения компонентов в бициллине-3.
Экспериментальная часть
Использовали бициллин-3 производства АКО "Синтез" (Курган). Исследование проводили на хроматографе фирмы "Waters" (США) с насосом модели 510, УФ-детектором модели 481 и инжектором модели 7125 (Rheodyne) с дозирующей петлей вместимостью 50 мкл. Для детектирования использовали длину волны 214 нм, при которой хорошо детектируются все анализируемые соединения. Регистрацию хроматограмм и расчет площадей пиков и основных параметров удерживания проводили с помощью персонального компьютера с аналого-цифровым преобразователем и программой "Мультихром".
Был изучен обращеннофазный вариант метода ВЭЖХ на колонке "Luna C18(2)" размером 250 х 4,6 мм фирмы "Phenomenex" (США), поскольку колонка зарекомендовала себя ранее как относительно дешевая с улучшенной симметрией выхода пиков органических аминов. С этой же целью в качестве подвижной фазы использовали смесь ацетонитрила с буферным раствором, содержащим в качестве одного из компонетов триэтиламин, имеющим pH 5,0.
Исходный раствор для приготовления подвижной фазы — 2,5 М раствор фосфорной кислоты, который титровали триэтиламином до рН 5,0. Буферный раствор для ВЭЖХ получали разбавлением исходного раствора водой в 10 раз. 750 мл полученного буферного раствора смешивали с 250 мл ацетонитрила. При этом значение кажущегося рН подвижной фазы повышалось до 5,7. Скорость подвижной фазы 1 мл/мин. Хроматографирование проводили при комнатной температуре. Время анализа 20 мин.
Поскольку входящие в состав препарата компоненты различаются по кислотно-основным свойствам — БП является кислотой, а новокаин и бензатин — основаниями, при увеличении рН их времена удерживания в интервале рН, где их ионизация меняется, сдвигаются в разные стороны. Поэтому путем изменения рН легко подобрать удобное удерживание анализируемых компонентов. Однако увеличение рН приводит к заметному ухудшению формы пика бензатина, а уменьшение — к недостаточному разрешению новокаина и продуктов гидролиза БП. Разделение компонентов бициллина-3 при указанных выше условиях представлено на рисунке. Времена удерживания новокаина, бензатина и БП составляли 4,2, 11,6 и 14,8 мин соответственно.
Существенным является выход пика новокаина между 2 пиками, представляющими собой продукты гидролиза БП. В связи с этим для лучшего разделения компонентов рекомендуется добавлять в подвижную фазу небольшие количества 2,5 М растворов фосфорной кислоты или триэтиламина и контролировать разделение хроматографированием смеси новокаина и БП, раствор которого хранился около суток при комнатной температуре.
Для количественного определения 20—25 мг бициллина-3 вносили в мерную колбу вместимостью 100 мл и растворяли в 20% водном растворе ацетонитрила. Использование для растворения метанола или его растворов вело к частичному метилированию БП. Увеличение концентрации ацетонитрила приводило к уширению пика новокаина. Верхний предел концентрации лекарственного вещества ограничен его растворимостью. Калибровочные графики для БП и бензатина получали с использованием натриевой соли БП и диацетата бензатина после соответствующего пересчета. Калибровочный график для БП линеен в области 0,1—0,5 мг/мл, для бензатина и новокаина — в области 0,01—0,05 мг/мл. Результаты определения компонентов в 5 сериях препарата представлены в табл. 1, где каждое значение представляет собой среднее из 5 определений. Относительное среднее квадратичное отклонение составило 1,6% для новокаина, 3,4% для бензатина и 1,4% для БП.
Из табл. 1 следует, что результаты количественного определения с помощью ВЭЖХ укладываются в допустимые пределы, регламентируемые НД.
Для подтверждения правильности предложенной методики были проанализированы компоненты бициллина-3 в модельных смесях, приготовленных смешением натриевой соли БП, бензатина диацетата и новокаина. Результаты приведены в табл. 2. Результаты пересчитаны на исходные компоненты.
Каждое значение в графе "Найдено" табл. 2 — средний результат 3 определений. Средняя величина относительного отклонения составила 2,2 % для бензатина, 0,9 % для новокаина и 0,8 % для БП, что коррелирует с относительными средними стандартными отклонениями, найденными при анализе компонентов в реальных пробах. Для бензатина разброс результатов несколько выше, чем для остальных компонентов, что объясняется низкой высотой и неправильной формой пика и соответственно большей ошибкой интегрирования. Другой причиной относительно больших ошибок при определении бензатина может явиться эффект памяти инжектора при анализе сильно адсорбирующихся веществ. Однако и такой разброс, несколько превышающий принятый для анализов с помощью метода ВЭЖХ, вполне допустим для определения бензатина.
Выводы
1. Разработана методика обнаружения и количественного определения компонентов в препарате "Бициллин-3".
2. Методика проверена на ряде серий препарата и подтверждена анализом модельных смесей известного состава.