7. Изучение неизвестных токсинов и других факторов патогенности микроорганизмов, механизмы действия которых недостаточно изучены.

Рис. 43. Иммуноцитохимическое выявление амидазы В. subtilis с использованием антител, меченных коллоидным золотом и электронной микроскопии

Локализацию определенных белков в поверхностных образованиях бактерий определяют иммуноцитохимическим методом. При этом бактерии обрабатывают антителами, меченными коллоидным золотом, а затем исследуют в электронном микроскопе (рис. 43). Золотая метка создает контрастную тень в месте связывания с бактериальными компонентами.

Для выявления факторов вирулентности мало изученных возбудителей проводят 2D-электрофорез в геле разрушенных ультразвуком вирулентных и авирулентных форм микроорганизмов, относящихся к одному виду (рис. 44 а, б). Сравнивают электрофореграммы и определяют расхождения между ними. Белки, присутствующие только у вирулентных микроорганизмов, секвенируют. Прогнозируют ген, кодирующий секвенированный белок. Проводят поиск гена в геноме бактерии, клонируют его в Е.coli, выделяют белок с использованием жидкостной хроматографии или капиллярного электрофореза, изучают структуру методами масс-спектрометрии, рентгеноструктурной кристаллографии (рис. 44 в). Аналогичным образом можно изучать не только клеточные лизаты бактерий, но и секретируемые в культуральную жидкость белки и токсины, для чего проводят 2D-электрофорез безмикробной культуральной жидкости. Кроме того, можно не выделять отдельные белки, так как использование масс-спектрометрии позволяет идентифицировать множество пептидов, находящихся в смеси.

Для выявления эффектов, оказываемых токсинами на клетки или ткани, проводят эксперименты на культуре клеток и лабораторных животных.

а б в

Рис. 44.Сравнительный 2D-электрофорез вирулентных (а) и авирулентных (б) форм одного вида микроорганизмов (стрелками обозначены белки, присутствующие только у вирулентных форм; 3D-структуру этих белков устанавливают рентгеноструктурным анализом (в))

8. Определение ферментов обмена веществ и ферментов-токсинов (см. определение биохомических свойств микробов – гемолизинов, лецитиназы, протеаз, липаз, плазмокоагулазы и др.).

9. Для выявления сенсибилизации к микробным аллергенам ставят кожно-аллергические пробы (например, пробу Манту).

10. Для выявления протективных антигенов (пептидов, приводящих к формированию противоинфекционного иммунитета) проводят сравнительный анализ геномов микроорганизмов и определяют спектр генов, которые потенциально могут кодировать протективные антигены. Эти гены клонируют в Е. coli, клонированные белки выделяют и изучают их иммуногенные свойства на лабораторных животных, проводят селекцию наиболее иммуногенных пептидов, которые могут стать компонентом вакцин.

Однако следует помнить, что не всегда патогенность возбудителя, выявляемая in vitro, соответствует реакциям, реализуемым возбудителем in vivo. Это связано с различием экспрессии генов в разных условия микроокружения. Молекулярно-генетические методы открыли новые возможности в изучении основных клеточных молекул. Зная геномы и протеомы возбудителей, человек получил возможность проникнуть еще глубже в понимание организации живого. Несмотря на это, пока не были сделаны глобальные открытия, позволяющие контролировать вирулентные свойства микробов, предотвращая развитие заболеваний.