microbio_zool

33

при 43оС, при этой температуре развивается только кишечная палочка теплокровных животных и человека, а другие микроорганизмы угнетены. На вторые сутки все объемы воды проверяются, отмечаются подозрительные на наличие E. coli (где обнаружены муть и газ в поплавках). Затем производят отсев бактериологической петлей на среду Эндо (или розоло-

вый дифференциальный агар – РДА) и инкубируют при 37оС 18 часов. Затем из ярко-красных колоний с бронзовым отсветом делают мазки, окрашивают по Граму и осуществляют дифференциацию кишечной палочки.

2. Метод глубинного посева. Этим методом определяют общее микробное число микроорганизмов воды. В стерильной чашке Петри исследуе-

мую воду в объеме 1 мл заливают расплавленным и остуженным до 45оС

МПА (15 мл). Инкубируют посев в термостате при 37оС в течение 48 часов и подсчитывают число колоний.

3.Метод мембранных фильтров. Данным методом определяют Coli-T

иColi-Ind с помощью аппарата для фильтрования воды (колбы Зейтца и фильтра Бунсена). Фильтры после фильтрации переносят в чашку Петри

со средой Эндо и помещают в термостат при 37оС на 24 часа. Наличие ярко-красных колоний с бронзовым отсветом будет свидетельствовать о подозрении наличия в данном объеме воды E.coli.

II.Микрофлора воздуха

Ввоздух микроорганизмы попадают с поверхности земли вместе с частицами пыли, из выделений живых организмов. Качественный и количественный состав микроорганизмов атмосферы зависит от: климатических условий, времени года, степени урбанизации территории и других причин.

Ввоздухе находятся наиболее устойчивые против высыхания и действия УФО микроорганизмы (пигментообразующие формы, микрококки, сарцины, споры бактерий и грибов, дрожжи). Могут встречаться и болезнетворные микроорганизмы, устойчивые к высушиванию (туберкулезные палочки, патогенные стрептококки и стафилококки, вирусы).

При санитарно-бактериологическом исследовании воздуха определяют ОМЧ воздуха и наличие санитарно-показательных микроорганизмов, по содержанию которых в воздухе можно судить о степени его чистоты. Такими организмами являются гемолититческие (растворяющие эритроциты

34

крови) стрептококки, которые постоянно обитают в верхних дыхательных путях, слизистой носа и ротовой полости человека, а также золотистый стафилококк и Гр(-) синегнойные бактерии (табл. 2).

Для очистки воздуха от микроорганизмов используют:

-дезинфекцию использование веществ, которые вызывают быструю гибель микробов;

-применение антисептиков, например триэтиленгликоля;

-использование УФО.

Та б л и ц а 2

Оценка воздуха по эпидемиологическому надзору в лечебнопрофилактических учреждениях и жилых помещениях

Методы санитарно-бактериологического исследования воздуха:

1. Аспирационный метод с помощью аппарата Кротова. Предназначен для исследования воздуха на присутствие гемолитического стафилококка. Для этого метода чашку Кротова с 5%-ным кровяным агаром помещают в аппарат Кротова и пропускают 250 литров воздуха. Посев инкубируют в

термостате при температуре 37оС в течение 48 часов. При наличии в воздухе - или -гемолитического стафилококка на среде вырастают колонии, окруженные зоной гемолиза.

2. Седиментационный метод по Коху. С помощью данного метода определяют общее микробное число воздуха. Общее микробное число воздуха рассчитывают по формуле Омелянского, который опытным путем

Х – количество микробов в 1 м3 воздуха – микробное число; А – количество колоний в чашке Петри; S – площадь чашки Петри (если d = 8,

то S = 50; d = 9, S = 63; d = 10, S = 78, 5 см 2); С – экспозиция посева.

III. Микрофлора почвы

Качественный и количественный состав микроорганизмов почвы зависит от: химического состава почвы, физических свойств, рН, влагоемкости, степени аэрации, климатических условий, времени года, способов сельскохозяйственной обработки, характера растительного покрова. Неодинаково распространение микроорганизмов по горизонтам почвы. Меньше всего их содержится в поверхностном толщиной несколько миллиметров слое, где микроорганизмы подвергаются неблагоприятному воздействию солнечного света и высушивания. Особенно обильно населен слой до 5 сантиметров, а по мере углубления число микроорганизмов уменьшается.

С глубиной меняется и качественный состав микроорганизмов. В верхних слоях почвы, содержащих много остатков животных и растений, а также подвергающихся хорошей аэрации, преобладают аэробные сапрофитные микроорганизмы, способные расщеплять сложные органические соединения. В почве могут обитать микроорганизмы, разлагающие клетчатку, нитрифицирующие, денитрифицирующие и азотфиксирующие формы. Среди болезнетворных бактерий в почве преобладают спорообразующие бактерии (возбудители столбняка, газовой гангрены, ботулизма), патогеные бесспоровые бактерии (брюшнотифозные, дизентерийные).

При санитарной оценке почвы критерием служит титр кишечной палочки и количество сапрофитных бактерий (табл. 3).

36

Т а б л и ц а 3 Оценка санитарного состояния почвы

по микробиологическим показателям

Методы санитарно-бактериологического исследования почвы:

1.Бактериологический метод. Данный метод позволяет определить микробное число почвы с помощью посева почвенной суспензии на МПА. При определении ОМЧ почвы подсчитывают число выросших колоний и делают перерасчет на 1 г почвы (число колоний умножают на коэффициент разведения).

2.Определение Coli-титра и перфингенс-титра почвы.

Ход работы:

I. Отобрать пробы воды для изучения микрофлоры. В чистые стерильные склянки (объем 400 500 мл) взять с соблюдением стерильности пробы воды из водопровода (предварительно водопроводный кран простерилизовать в пламени спиртовки и пропустить воду в течение 10 15 минут).

II. Для определения микробного числа воды произвести посев воды в стерильные чашки Петри и залить расплавленным и остуженным до

40 50оС МПА. Вылитый агар слабым покачиванием равномерно смешать с исследуемой водой. Посевы подписать и поместить в термостат при 37оС на 24 48 часов.

III.Поставить опыты для определения Coli-T и Coli-Ind.

Бродильным методом (разбор).

Методом мембранных бумажных фильтров: мембранные фильтры № 3 дважды покипятить в дистиллированной воде. Стерильные фильтры стерильным пинцетом вложить в стерильный фильтр Зейтца, установленный на колбе Бунзена, соединенной с вакуумным насосом, и произвести фильтрование воды в общем объеме жидкости 333 мл. Стерильным пинцетом перенести прокипяченные мембран

37

ные фильтры на чашку Петри со средой Эндо лицевой стороной

вверх. Посевы подписать и поставить в термостат при 37оС на 24 часа. IV. Поставить опыты для определения ОМЧ почвы:

Почвенную болтушку в разведении 1:10 взболтать и дать отстояться в течение 5 10 минут. Из почвенной суспензии приготовить ряд последовательных разведений (1:100, 1:1000 и т.д.);

Из двух последних разведений по 1 мл почвенной взвеси внести в чашку Петри и залить расплавленным и остуженным до 45 50оС МПА. Вылитый агар равномерно смешать с исследуемой суспензией. Посевы подпи-

сать и поставить в термостат при 37оС на 24 48 часов.

Определение Coli-титра и перфингенс-титра (разбор).

V. Поставить опыты для определения ОМЧ воздуха методом Коха:

Чашки Петри с МПА открыть и выдержать открытыми в течение 5 10

минут. Чашки закрыть, подписать и поставить в термостат при 37оС на

24 48 часов;

Для определения санитарно-показательных микроорганизмов этим мето-

дом чашки с КА открыть и выдержать открытыми 40 минут.

VI. Рассчитать микробное число воды, воздуха, почвы. Определить Coli-титр и Coli -индекс воды; полученные данные сравнить с допустимыми санитарными нормами и сделать выводы. Результаты исследований занести в протокол.

Тесты для проверки знаний:

1.Микробное число воздуха определяют: а) по методу Коха, б) на среде Эндо, в) посевом на чашку с МПА в аппарате Кротова, г) с помощью формулы Омелянского.

Ответ: а, в, г

2.Санитарно-бактериологическую оценку воды выводят исходя из: а) цветности, б) микробного числа, в) Coli-титра, г) запаха, д) Coliиндекса.

Ответ: б, в, д

Ключевые слова: индикаторные микроорганизмы, микробное число, Coli-титр, Coli-индекс, перфингенс-титр, сапробность

Занятие № 8

Тема: Реакции иммунитета.

Цель занятия: Обучить постановке и учету реакций агглютинации и преципитации Материалы и оборудование: Предметные стекла, исследуемая чистая куль-

тура E.coli на скошенном МПА, агглютинирующая сыворотка E.coli, испытуемый экстракт для реакции кольцепреципитации, преципитирущая туляримийная сыворотка, преципитирующая сибироязвенная сыворотка, нормальная сыворотка, люминесцирующие сыворотки, пипетки мерные и пастеровские.

Демонстрация:

1.Ряд с развернутой реакцией агглютинации для учета.

2.Планшет с РНГА для учета.

3.Планшет с ИФА для учета.

4.Реакция по Манчини для учета.

5.Реакция по Оухтерлони для учета.

Вопросы для обсуждения:

1.Антигены, химическая природа.

2.Антитела, структура иммуноглобулинов.

3.Принцип использования серологических реакций.

4.Реакции агглютинации, ингредиенты, способы постановки.

5.Нагрузочные реакции агглютинации.

6.Реакции преципитации, ингредиенты, способы постановки.

7.Реакции с метками. Варианты. Учет реакций.

I.Введение

Воснове всех реакций иммунитета лежит специфическое взаимодействие антитела (Ат) с антигеном (Аг). Эти реакции называют серологическими, так как для их постановки используют сыворотки (serum), содержащие Ат. В серологических реакциях один компонент (ингредиент) должен быть всегда известен.

Серологические реакции применяются в следующих случаях:

а) для определения неизвестного Аг (бактерия, вирус, токсин и др.) с помощью известного Ат (иммунная сыворотка); б) для определения Ат в сыворотке с помощью известного Аг.

39

В зависимости от состояния Аг и особенностей среды, в которой взаимодействуют Аг и Ат, различают реакции агглютинации, преципитации, лизиса, связывания комплемента, иммунофлюоресценции, иммуноферментного анализа, радиоиммунного анализа и другие.

II. Реакции агглютинации

Феномен агглютинации заключается в способности антитела связываться с микробными клетками и другими корпускулярными антигенами в присутствии электролита. Образующийся агрегат выпадает в осадок. Различают реакции прямой и непрямой агглютинации.

В реакциях прямой агглютинации Ат агглютинируют непосредственно корпускулы, связываясь с входящими в их состав антигенными детерминантамии.

Рис. 2. Реакция прямой агглютинации: 1– клетка; 2 Аг; 3 – Ат

Существует два основных метода постановки реакции агглютинации: реакция на стекле и развернутая реакция (пробирочный вариант).

1. Пластинчатая реакция агглютинации на стекле (ориентировочная).

На обезжиренное предметное стекло наносят каплю иммунной сыворотки и каплю изотоничного раствора. В обе капли бактериологической петлей вносят культуру микроорганизмов и тщательно перемешивают. Если через 3 5 минут в капле физиологического раствора наблюдается равномерное помутнение, а в капле сыворотки хлопья или зерна агглютината, то результат реакции считается положительным.

2. Развернутая реакция агглютинации.

Готовят в пробирках последовательные разведения сыворотки (чаще двукратные: 1:50 1:100 1:200 и т.д.). Во все пробирки (кроме одной контроль сыворотки) вносят по две капли корпускулярного Аг (диагностикума). Диагностикум вносят и в пробирку с физиологическим раствором,

40

которая служит контролем Аг. В результате реакции в пробирках должно появиться помутнение. Пробирки встряхнуть и поставить в термостат при 37 градусах. Учитывать через 18 20 часов, начиная с контролей.

Контроль Аг должен быть равномерно мутным; контроль Ат совершенно прозрачным. При положительном результате реакции в пробирках появляется осадок, жидкость над осадком при этом просветляется. Титром сыворотки считается ее наибольшее разведение, в котором наблюдается четкая агглютинация.

3. Реакцию непрямой (пассивной)агглютинации ставят с растворимыми антигенами белковой или полисахаридной природы. Аг предварительно адсорбируют на корпускулярном носителе, которым служат инертные вещества (латекс, бентонит) или клетки, например эритроциты (препарат эритроцитарный диагностикум). Чаще адсорбентом являются эритроциты, реакция при этом носит название пассивной (непрямой) гемагглютинации (РПГА). При постановке реакции к исследуемой сыворотке (Ат?) с разными разведениями добавляют эритроцитарный диагностикум. В положительном случае происходит гемагглютинация.

Рис. 3. Реакция пассивной гемагглютинации:1 эритроциты, 2 Аг эритроцита, 3 – конъюгированный Аг, 4 Ат

41

4. Реакцию преципитации ставят в тех случаях, когда в качестве антигена пользуются веществами: лизатами, экстрактами, гаптенами и т.п. При взаимодействии такого антигена с антителом в присутствии электролита образуется преципитат в виде мутного кольца или осадка.

Реакцию преципитации обычно применяют для определения Аг при диагностике ряда инфекционных болезней (сибирской язвы, туляремии, пастереллеза и др.); в судебной медицине – для определения видовой принадлежности крови; в санитарно-гигиенических исследованиях при установлении фальсификации продуктов; для количественного определения белков, участвующих в защите животных: иммуноглобулинов, комплемента, лизоцима и других. С помощью реакции преципитации также определяют филогенетическое родство животных, растений и микроорганизмов. Основными методами проведения реакции преципитации являются реакция кольцепреципитации и реакция преципитации в геле.

5.Реакция кольцепреципитации. Реакцию проводят в специальных пробирках диаметром 0.4 0.5 см и высотой 7 8 см. В пробирку вносят 0.2 мл иммунной сыворотки; на сыворотку осторожно наслаивают такой же объем Аг , чтобы не произошло смешивание ингредиентов. При положительном результате на границе Аг и Ат образуется белое кольцо – преципитат.

6.Реакция преципитации в геле. Особенность этой реакции в том, что взаимодействие Аг с Ат происходит в полутвердой среде – геле, чаще агаровом. Так как молекулы Ат и Аг диффундируют в геле, то этот метод часто называют иммунодиффузией. При встрече в геле комплементарных друг другу Ат и образуется белая линия, полукольцо или кольцо.

В основном используется 2 варианта иммунодиффузии в геле: а) по Манчини (простая, радиальная диффузия) (рис. 4); б) по Оухтерлони (двойная иммунодиффузия) (рис. 5).

По методу Манчини Ат к искомому Аг (любому белку) вносятся в теплый (50 оС) жидкий гель. Гель с антителами выливается на стеклянную поверхность, и когда он застывает, в нем делают лунки, куда и вносят искомый Аг. Аг диффундирует в гель и, соединившись со специфическими Ат, формирует кольца преципитации, диаметры которых зависят от концентрации Аг в лунках.

Реакция Манчини используется для количественного определения любого молекулярного Аг, так как с помощью колибровочных кривых измерив диаметр кольца, можно выявить количество Аг.

42

Рис. 4. Простая радиальная иммунодиффузия: кольца преципитации, калибровочная кривая.

По методу Оухтерлони Аг и Ат (одно известное, другое нет) помещают в лунки геля, вырезанные на некотором расстоянии друг от друга. Оба ингредиента диффундируют в гель, и если они друг другу комплементарны, на месте их встречи образуется белая линия. Этот метод используется для качественного анализа.

Рис. 5. Двойная радиальная иммунодиффузия: 1 – Аг, 2 – Ат, 3 – линия преципитации

В последние годы широко применяются серологические реакции, в которых используются меченые тем или иным способом антитела (иногда антигены). Меченые Ат не изменяют своей специфичности. Основные требования к метке: она должна легко выявляться, сохраняя специфичность иммунологических реакций. Серологические реакции с использованием метки позволяют быстро получать результат, отличаются высокой