4.2 Обґрунтування вибору доферментаційних процесів
4.2.1. Підготовка поживного середовища
Ферментаційна середу для біосинтезу стрептоміцину штамом Streptomyces griseus, що містить джерела вуглецю, соєве борошно, сульфат амонію, амоній або калій фосфорно-кислий двозаміщений, натрій хлористий, карбонат кальцію і воду, знана тим, що в якості джерела вуглецю вона містить суміш глюкози з іншим вуглеводом , вибраним з групи фруктоза, галактоза, мальтоза, лактоза, декстрин, крохмаль, або суміш глюкози з гліцерином у співвідношенні швидка мінливість.
Ваксман із співробітниками в 1946 р. повідомив, що стрептоміцин синтезується при розвитку лише в середовищах, що містять у своєму складі м'ясний екстракт, і рекомендував для росту антибіотика наступну середу:
РН такого середовища встановлюється в межах 6,5-7,0.М'ясний екстракт 3. Ваксман розглядав не тільки як джерело азоту, але як продукт, що містить якесь «пробиотическое» речовина, без якого нібито антибіотик не виробляється.Проте вже в тому ж 1946 було показано, що м'ясний екстракт можна з успіхом замінити дріжджовим, а пізніше з'явилися роботи, що показали, що освіта стрептоміцину відбувається середовищах, де м'ясний екстракт замінений соєвим борошном, або кукурудзянимекстрактом, або гідролізатами, отриманими з цих речовин. Більш того, було встановлено, що синтез антибіотика мо- може відбуватися і на простих за складом синтетичних середовищах.Таким чином, припущення 3. Ваксмана і його колег проможливості освіти стрептоміцину тільки в присутності якогось «пробіотичного» речовини, що міститься в м'ясному екстракті, не підтвердилося.Ці приклади показують, що на самому початку вивчення умов вироблення стрептоміцину дослідники зіткнулися з впливом на процес біосинтезу антибіотика різних компонентів середовищ, і в першу чергу джерел азоту, вуглецю, а також концентрації фосфору.
Джерела азоту. Для розвитку стрептоміцетами і біосинтезу стрептоміцину в синтетичних середовищах найбільш сприятливі амонійні солі. Нітрати в якості єдиних джерел азоту продуцентом стрептоміцину не використовуються, але при додаванні до середовища дріжджового екстракту стрептоміцетами починає їх споживати. По-видимому, неможливість використання стрептоміцетами нітратів пов'язана з відсутністю у нього донорів водню, що заповнюється додаванням до середовища дріжджового автол .Натомість присутність нітрату натрію в середовищі, що міститькукурудзяний екстракт, призводить до зміни всього процесу обміну речовин стрептоміцетами. Так, концентрація KNO3, рівна 0,25%, перешкоджає залученню в обмін речовин стрептоміцетами молочної кислоти, що знаходиться в кукурудзяному екстракті; при 0,5% KNO3 кислота споживається, а при 1% - вона не тільки використовується організмом, але й утворюється їм знову.
Джерела вуглецю. Найкращим джерелом вуглецю для Streptomyces griseus розвитку і освіти антибіотика, за даними більшості авторів, вважається глюкоза. Стрептоміцетами добре росте в середовищах з глюкозою, фруктозою, галактозою, ксилозою, мальтозою,лактозою чи крохмалем, але не росте в середовищах з арабінозой, сахарозою, рафіноза, сорбітом, дульцітом. Продуцентстрептоміцину не може гідролізувати сахарозу і рафіноза. Здатність використовувати той чи інший джерело вуглецю та продукувати антибіотичну речовину залежить від штаму стрептоміцетами.Майже всі штами, що утворюють стрептоміцин, можуть використовувати тваринні жири, рослинні олії або жирні кислоти (олеїнова, пальмітинова) в середовищах, що не містять глюкозу. Масла сприяють збільшенню біомаси стрептоміцетами, прискорюють споживання джерел азоту і разом з тим уповільнюють використання глюкози. Вплив масел залежить насамперед від виду масла, складу середовища і штаму стрептоміцетами. Шлях використання масла стрептоміцетами, мабуть, той же, що і для інших організмів: гідроліз до гліцерину і жирних кислот з подальшим C-окисленням їх. Спирти, за винятком маніту і гліцерину, непридатні для росту стрептоміцетами і синтезу антибіотика.З органічних кислот молочна, піровиноградна та лимонна в синтетичних середовищах стимулюють утворення стрептоміцину. Використання суміші яблучної і янтарної кислот в середовищі, що містить основні амінокислоти, сприяє значному збільшенню продукування антибіотика. Разом з тим винна кислота, не підвищуючи виходу стрептоміцину,позитивно впливає на ріст стрептоміцетами. Джерела мінерального живлення та їх роль в процесі біосинтезу стрептоміцину. Життєдіяльність продуцента стрептоміцину і його біосинтетичних активність забезпечуються наявністю в середовищі таких компонентів, як фосфор, залізо, кальцій та інші мінеральні речовини.
Фосфор. Фосфор має важливе значення в розвитку С. пзеіз і освіті антибіотика.Збільшення концентрації фосфору в середовищі до певного межі підсилює вироблення стрептоміцину, подальше ж підвищення вмісту фосфору, не роблячи помітного впливу на ріст міцелію, знижує утворення антибіотика. Надлишок фосфору в середовищі впливає на біохімічний склад цитоплазми, змінює цикл розвитку стрептоміцетами і порушує деякі фізіологічні функції клітин.Значне збільшення вмісту неорганічного джерела фосфору прискорює споживання вуглеводів і пригнічує розвиток стрептоміцетами, а отже, і вироблення стрептоміцину. При надлишку фосфору в середовищі, що містить глюкозу, збільшується накопичення піровиноградної кислоти, але такий закономірності не спостерігається у випадку використання крохмалю. Залежність освіти стрептоміцину від концентрації фосфору в середовищі може бути проілюстрована даними росту антибіотика при певних концентраціях фосфорнокислого амонію в середовищі з проліном:
При нестачі в середовищі фосфору життєдіяльність актинміцета значно змінюється, що пов'язано з порушенням засвоєння вуглеводів, азоту та з потребами в кисні. Все це обмежує ріст міцелію продуцента (він стає фізіологічно неповноцінною), вміст фосфору в ньому зменшується і здатність до біосинтезу антибіотика знижується. Таким чином, властивість міцелію утворювати антибіотик тісно пов'язане з кількістю фосфору в ньому. При розвитку стрептоміцета в середовищі, що містить глюкозу, м'ясний екстракт і пептон, відбувається швидке споживання неорганічного фосфору: кількість його за період розвитку культури знижується зі 118 до 1 мкг / мл.Споживання фосфору стретоміцетом в більшій мірі залежить від вихідної концентрації цього елемента в субстраті. Так, на середовищі з вихідною кількістю фосфору, рівним 29 мкг / мл, до 48-му годині споживається 21 мкг / мл, а при вихідній концентрації, рівною 128 мкг / мл, кількість спожитого фосфору зростає до 118 мкг / мл за той же період. Ці дані вказують на те, що в Залежно від початкової концентрації фосфору в середовищі істотно змінюється якість вирослого міцелію стрептоміцетами, а отже, і умови утворення стрептоміцину.Зміни у вуглеводному і фосфорному харчуванні, в свою чергу, викликають зміни в нуклеїнових обміні культури і в загальному процесі розвитку продуцента стрептоміцину.Оптимальний вміст фосфору, рівне 0,04-0,07 мг / мл,сприяє гарному росту і розвитку стрептоміцетами і високому рівню біосинтезу стрептоміцину. Однак найбільш сприятлива для росту продуцента та освіти стрептоміцину концентрація фосфору в середовищі залежить від штаму стрептоміцетами, складу середовища і способу її приготування. Залізо, цинк, мідь, магній. Важливе значення в процесі разів- Streptomyces griseus розвитку і освіти антибіотика мають такі елементи, як залізо, цинк, мідь, магній та ін.Максимальний вихід стрептоміцину спостерігається при умо- умови утримання FeSO4 * 7Н2О в середовищі в кількості 0,0007-0,005%. Збільшення концентрації сірчанокислого заліза до 0,05% призводить до пригнічення біосинтезу антибіотика, зниження швидкості споживання вуглеводів і до затримки розвитку стрептоміцетами. Додавання відповідної кількості фосфору до середовища з надлишком заліза знімає несприятливу дію іонів заліза на біосинтез стрептоміцину. Ймовірно, негативний ефект від надлишку заліза в середовищі визначається тим, що він пов'язує іони фосфору.
Іони магнію відіграють важливу роль в азотному обміні актиноміцета, а також в реакціях фосфорилювання. Що стосується міді, то роль цього елемента в життєдіяльності життєдіяльності продуцента стрептоміцину та освіті антибіотика не цілком ясна. Однак відомо, що збільшення концентрації мідідо 50 мг% істотно не впливає на утворення стрептоміцину, але пригнічує ріст стрептоміцетами. Збільшення концентрації цинку і заліза до 50 мг% сильнопригнічує утворення стрептоміцину (до 50% у порівнянні з контролем). Хлорид натрію. До складу всіх середовищ, використовуваних для росту стрептоміцину, входить хлорид натрію NaCl. Було відмічено, що без кухонної солі антибіотична активність культуральній рідини нижче активності цієї рідини, утримуючи-містить NaCl. У присутності хлориду натрію збільшується проникність клітинної стінки і стрептоміцин легше переходить у навколишнє середовище. Утворюється стрептоміцин не повністю виділяється в середу: певна частина його міцно пов'язана з клітинними стінками міцелію стрептоміцетами і може бути витягнута при обробці міцелію кислотою, лугом або сіллю. Для з'ясування ролі кухонної солі в процесі біосинтезу стрептоміцину були проведені досліди по вирощуванню середовищах з хлоридом натрію і без нього, які показали, що зміст антибіотика дійсно трохи вище в середовищі з NaCl. Однак при кислотної обробці міцелію в цілях витягання пов'язаного стрептоміцину виявилося, що загальний вихід антибіотика вище на середовищі, що не містить NaCl. Отже, наявність хлориду натрію в середовищі не спосіб- сприяє біосинтезу стрептоміцину, а лише полегшує виділення утворився антибіотика з міцелію в середу.Аналогічну роль хлорид натрію грає у виділенні з клітин мікромоноспора антибіотика сізоміцін
Кальцій. Як елемент мінерального живлення кальцій сам пособі не робить істотного впливу на біосинтез стрептоміцину, однак в залежності від складу середовища він може грати позитивну або негативну роль. Так, при стерилізації середовищ, що містять фосфати, в присутності іонів кальцію зазвичай іони фосфорної кислоти зв'язуються з кальцієм у вигляді нерозчинних сполук. Якщо в середовищі фосфор знаходиться в обмеженій кількості, це знижує біосинтез стрептоміцину, але при використанні середовищ з надлишковим вмістом фосфатів внесення кальцієвих солей перед стерилізацією може перевести частину фосфору в нерозчинні кальцієві сполуки з'єднання, тобто створяться умови, сприятливі для біосинтезу антибіотика. Крім того, іони кальцію і магнію регулюють значення рН середовища при підкисленні її за рахунок залишків сірчаної, фосфорної або інших мінеральних кислот при використанні амонійних солей, наприклад (NH4JSO4, (NH4JHPO4.Іони Са2 + активують такі ферменти, як ліпази, і деякі інші. Вони можуть також ігнорувати функції ферментів, що активуються магнієм.
|
ГОСТ 24353 |
|
ГОСТ 111-75 |
|
ГОСТ 34472-11 |
|
ГОСТ 7654-15 |
|
ГОСТ 6547-77 |
|
Глюкоза |
|
Соева мука Сульфат амонія |
|
Амоній фосфорнокислий |
|
Натрій хлористий |
|
Карбонат кальція |
|
|
|
15 |
|
6 |
|
2,5 |
|
0,12 |
|
0,5 |
|
2,5 |