Техника безопасности

• Соблюдайте особую осторожность при работе с концентри-рованными кислотами, с раствором трихлоруксусной и сульфосалициловой кислот, с 10%-м раствором щелочи.

• Будьте внимательны при нагревании растворов.

1.2.Методы количественного определения белков

РАБОТА 3. КОЛИЧЕСТВЕНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА

В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ

Цель работы:ознакомиться с одним из распространённых методов количественного определения белка в сыворотке крови.

Задачи:

• построить калибровочную кривую по стандартным растворам белка;

• определить содержание белка в предложенной сыворотке крови;

• проанализировать полученные результаты и сделать выводы.

Принцип метода.Белки в щелочной среде реагируют с сульфатом меди с образованием комплексных соединений, окрашенных в сине-фиолетовый или красно-фиолетовый цвет (биуретовая реакция). Интенсивность окраски пропорциональна содержанию белка в растворе.

Ход работы

1. Построение калибровочной кривой

Готовят семь рабочих стандартных растворов белка разведением основного стандартного раствора (содержит 4 мг белка в 1 мл) дистиллированной водой, как указано в таблице.

№проб	Стандартный раствор, мл	Н2О, мл	Содержание белка в пробе, мл	Еср
1	0,25	1,75	1,0
2	0,50	1,50	2,0
3	0,75	1,25	3,0
4	1,00	1,00	4,0
5	1,25	0,75	5,0
6	1,50	0,50	6,0
7	1,75	0,25	7,0
Контроль	-	2,00	-	-
Сыворотка	-	-

Во все рабочие стандартные растворы и контроль добавляют по 2,5 мл биуретового реактива, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 минут для развития окраски. Окрашенные стандартные растворы колориметрируют на ФЭКе против контроля в кюветах на 5 мм с зелёным светофильтром (длина волны 540 нм). Полученные значения оптической плотности используют для построения калибровочной кривой.

2. Количественное определение белка в сыворотке крови

Исследуемую сыворотку крови разбавляют дистиллированной водой в 40 раз (1 мл цельной сыворотки смешивают с 39 мл Н₂О).

К 2 мл разбавленной сыворотки добавляют 2,5 мл биуретового реактива и после перемешивания оставляют при комнатной температуре на 30 минут, а затем колориметрируют. Измерение оптической плотности производят так же, как при построении калибровочной кривой (используют тот же контроль, что и для построения калибровочной кривой). Содержание белка в пробе определяют по калибровочной кривой.

Результаты:

Калибровочная кривая

Х = (А / 2 × 40 × 100) / 1000 = А × 2 (г%),

где А – количество белка в пробе, определённое по калибровочной кривой,

А/2 – количество белка (мг) в 1 мл разбавленной в 40 раз сыворотки крови,

100 – для пересчёта на 100 мл сыворотки (для выражения показателя в мг%),

1000 – для перевода единиц в г%.

В сыворотке крови здорового человека содержится 6,5-8 г% белка.

Выводы:

РАБОТА 4. определение концентрации гемоглобина

в крови колориметрическим (унифицированным) методом

Цель работы: ознакомиться с современным, применяемым в клинической практике, методом количественной оценки содержания гемоглобина в крови.

Задачи:

• освоить унифицированный метод определения содержания гемоглобина в эритроцитарной взвеси, полученной из крови человека;

• проанализировать полученные результаты и сделать выводы.

Принцип метода. Под действием феррицианида калия и цианида гемоглобин трансформируется в цианометгемоглобин, определяемый фотометрически.

Ход работы. С помощью автоматических пипеток в пробирку вносят 2 мл рабочего реагента и 0,01 мл крови. Через 5 минут пробы колориметрируют на ФЭКе против рабочего реагента в кюветах с толщиной поглощающего слоя 3 мм при длине волны 520-560 нм.

В норме содержание гемоглобина у мужчин колеблется в пределах 13,2-16,4 г%, женщин – 11,5-14,5, детей – 11,5-14,5 и новорожденных – 15-24 г%.

Результаты:

Концентрацию гемоглобина (С) рассчитывают в г% (в г на 100 мл крови):

С = Е_оп× 62,8 (г%),

где: Е_оп– экстинкция пробы.

Для выражения концентрации гемоглобина в г/л результат умножают на 10.

Выводы: