Хроматология

Хроматология представляет собой группу методов, предназначенных для разде­ления смесей веществ на компоненты. Заметим, что хотя термин «хроматография» уже прочно устоялся, в действительности его употребление ошибочно: в совре­менных методиках для идентификации веществ не используют цвета компонентов смесей. Одна из фаз (жидкая или твердая) является неподвижной, а другая (жид­кая или газообразная) — подвижной. Если в качестве неподвижной используется жидкая фаза, то процесс называется распределением. Если в качестве неподвиж­ной используется твердая фаза, то процесс называется адсорбцией.

Для разделения компонентов смеси, в хроматологии используют разность в скорости их движения в подвижной фазе, вызванную взаимодействием этих ве­ществ с неподвижной фазой.. В хроматографических методах ис­пользуются четыре возможные комбинации подвижной и неподвижной фаз.

С точки зрения применения в клинической лаборатории, эти методы используются в первую очередь для детектирования сложных веществ, таких как лекар­ственные препараты и гормоны. Например, с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ) и тонкослойной хроматографии (ТСХ) удобно определять, какой именно препарат (или препараты) использовался в случае его передозировки. Наличие этой информации жизненно необходимо для врача, который должен выбрать надлежащие терапевтические процедуры..

Газожидкостныё хроматографы

Основные элементы ГЖХ показаны на рис. 1 1.7. Перед вводом в ГЖХ полученный от пациента образец обычно подвергается процедуре предварительной очист­ки, степень которой зависит от выполняемого анализа. Основные подсистемы хроматографа выполняют следующие функции: Инжектор. Инжектор предназначен для ввода в ГЖХ 1 —5 мл раствора образца (обычно в летучем органическом растворителе). Температура в инжекторе такова, что растворитель с образцом мгновенно испаряются.

Газ-носитель. Инертный газ-носитель (обычно это N₂ или Не) является под­вижной фазой хроматографа. Он несет испаренный образец и газообразный растворитель вниз по колонке.

Колонка. Колонка обычно имеет длину 1 м и диаметр менее 7 мм. Она упа­кована твердой поддерживающей матрицей (например, диатомовой землей). На твердую матрицу нанесена жидкая фаза. Малый размер твердых гранул обеспе­чивает разделение компонентов. Колонка помещена в термостат, температура в котором тщательно контролируется. Программатор температуры постепенно увеличивает температуру колонки в последовательности, подобранной для полу­чения максимальной эффективности выделения именно того вещества, которое анализируется.

Детектор. Детектор располагается на конце колонки. Его функция заклю­чается в том, чтобы выдавать электрический сигнал, пропорциональный количест­ву вещества в выходящем потоке газа. Имеется ряд типов детекторов, предназна­ченных для использования с различными типами образцов. Среди них — ионизаци­онные детекторы, детекторы по теплопроводности и электронозахватные детекто­ры. Для применения в клинической лаборатории наиболее часто используются ионизационные детекторы (Littlewood, 1970).

Все детекторы чувствительны к целым классам веществ, а не к какому-либо одному определенному анализируемому веществу. Таким образом, для определе­ния типов и количеств отдельных компонентов, присутствующих в образце, ис­пользуются как концентрации детектируемых веществ, так и периоды времени, по истечении которых эти концентрации регистрируются (т.е. график зависимо­сти концентрации от времени). Электрический выход детектора подключается к самописцу.

Самописец. У самописца по оси х откладывается время, а по оси у— интенсив­ность выходного сигнала детектора. Таким образом, хроматограмма показывает как количества присутствующих компонентов (площади соответствующих пиков), так и времена удержания, с которыми эти вещества элюируются из колонки. Исходя из этой информации, присутствующие компоненты могут быть идентифицированы по их временам удержания или, предпочтительнее, путем сравнения с хроматограмма-ми, полученными в результате ГЖХ-анализа веществ известной структуры.

Рис. 11.7 Блок-схема газожидкостного хроматографа (ГЖХ).

На рис. 11.8 показана хроматограмма, полученная при анализе образца крови на содержание известных противосудорожных препаратов - фенобарбитала и фенитоина. В качестве внутреннего стандарта в образец было добавлено из­вестное количество гептабарбитала. Для вычисления уровней содержания фенобарбитала и фенитоина площади пиков, соответствующих этим препаратам, срав­нивались с площадью пика гептабарбитала. Газожидкостная хроматография дает ряд важных преимуществ при анализе сложных соединений: скорость, возможность работать с малыми количествами об­разца и высокая чувствительность. Большинство приборов могут осуществлять анализ клинически значимых веществ менее чем за 1 ч, а часто даже менее чем за 15 мин, причем для анализа требуется лишь около 1 мл образца. Чувствительность прибора зависит от типа используемого детектора. Высококачественные приборы способны анализировать 1 нг вещества.

Рис. 11.8 Пример хроматограммы ГЖХ для анализа уровня содержания в крови фено­барбитала (пик а) и фенитоина (пик с). Пик b соответствует уровню гептабарбитала (внутренний стандарт).

ГЕМАТОЛОГИЯ

ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ

Кровь состоит из форменных элементов, растворенных веществ и воды. В этом разделе описаны только те приборы, которые измеряют характеристики формен­ных элементов: эритроцитов (ЭРЦ), лейкоцитов (ЛКЦ) и тромбоцитов (ТРЦ). Ос­новной функцией ЭРЦ является перенос кислорода из легких к различным орга­нам и перенос двуокиси углерода из этих органов к легким для его выведения из организма. Основной функцией ЛКЦ является участие в защите организма от ин­фекций. В периферической крови в норме обнаруживаются пять типов ЛКЦ. В по­рядке уменьшения содержания в крови взрослого человека, это нейтрофилы, лим­фоциты, моноциты, эозинофилы и базофилы. При заболеваниях суммарные коли­чества и пропорции ЛКЦ этих типов могут изменяться; могут также появляться незрелые и злокачественно трансформированные типы ЛКЦ. Тромбоциты заты­кают мелкие разрывы в стенках кровеносных сосудов, а также участвуют в меха­низме свертывания крови.

Основным показателем форменных элементов крови является число элемен­тов каждого типа в микролитре (мкл) крови. Нормальный диапазон содержания ЭРЦ для взрослого мужчины составляет 4.6—6.2 х 10 /мкл, а для взрослой жен­щины 4.2—5А х 10⁶/мкл. Нормальные диапазоны содержания ЛКЦ и тромбоци­тов для мужчин и женщин одинаковы. Нормальный диапазон содержания ЛКЦ составляет 4500— 11000/мкл, а нормальный диапазон содержания тромбоцитов равен 150000—40000/мкл. Гематокрит (ГМК) — это отношение объема всех фор­менных элементов крови к суммарному объему образца крови. Гематокрит выра­жается в процентах, и его нормальный диапазон для взрослого мужчины составля­ет 40—54%, а для взрослой женщины 35-47%. Гемоглобин (Но) является конъюгированным белком, находящимся внутри ЭРЦ. Этот белок транспортирует основную часть О₂ и часть СО₂, переносимых кровью. Его содержание выражается в граммах на децилитр. Нормальный диапазон для взрослого мужчины составляет 13.5—18 г/дл, а для взрослой женщины этот диапазон равен 12—16 г/дл.

Вторая группа измерений проводится для оценки объемов клеток ЭРЦ и кон­центрации Нb. Эти измерения включают в себя определение среднего объема кле-