Люминесцентный микроскоп биомед 2л

Люминесцентный микроскоп БИОМЕД 2Л предназначен для иммунологических исследований с применением флюоресцирующих и ферментных меток, а также гистологических и цитологических исследований в клинической лабораторной диагностике.

Микроскоп БИОМЕД 2Л — тринокуляр, объективы Флюорат, 10х, 20х, 40х, 100хМИ, осветитель 25 Вт, возбуждение 360-550 нм, запирающий фильтр 420-650 нм, ртутная лампа 100 Вт/2, фазовый контраст.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

Приборы, основанные на электрофоретическом принципе, используются в клини­ческой лаборатории для измерения количеств различных типов белков в плазме, моче и спинномозговой жидкости. Они также применяются для разделения фер­ментов на составляющие их изоферменты, для идентификации антител и для ряда других приложений.

ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

В общем случае явление электрофореза может быть определено как движение твердой фазы относительно жидкой (буферного раствора). Основная функция бу­ферного раствора заключается в том, что он проводит электрический ток и под­держивает постоянное значение рН раствора в процессе миграции. Буферный рас­твор стабилизируется твердой матрицей, называемой поддерживающей средой.

Наше обсуждение в данном разделе будет ограничено зональным электрофо­резом. В этой методике образец вводится в поддерживающую среду, и под дейст­вием электрического поля частицы с одинаковым зарядом, одинакового размера и формы, мигрируют с одинаковой скоростью. Это приводит к разделению частиц по зонам. Факторы, влияющие на скорость миграции частиц в электрическом поле, описываются в следующих параграфах:

Величина заряда. Подвижность данной частицы непосредственно зависит от суммарной величины ее заряда. Подвижность определяется как «расстояние, вы­раженное в сантиметрах, которое частица проходит за единицу времени при еди­ничной напряженности поля, выраженной как падение напряжения на сантиметр» [подвижность = см /(В • сек)].

Ионная сила буфера. Чем больше концентрация буфера, тем меньше ско­рость миграции частиц. Это происходит потому, что чем большую долю суммарно­го заряда составляют буферные ионы, тем большую долю суммарного тока они не­сут. Кроме того, это происходит вследствие взаимодействия буферных ионов с частицами.

Температура. Подвижность непосредственно зависит от температуры. Сопротивление поддерживающей среды проходящему току производит тепло. Это тепло влияет на электрофоретический процесс двумя путями. Во-первых, оно вы­зывает рост температуры поддерживающей среды, что приводит к уменьшению ее сопротивления и, как следствие, к увеличению скорости миграции. Во-вторых, те­пло вызывает испарение воды с поверхности поддерживающей среды. Это приво­дит к увеличению концентрации частиц и еще более увеличивает скорость мигра­ции. Вследствие этих эффектов, для достижения приемлемой воспроизводимости результатов процедуры необходимо поддерживать на постоянном уровне либо приложенное напряжение, либо силу тока. Для коротких разделений при относи­тельно невысоком напряжении можно поддерживать постоянным как напряжение, так и ток. Однако, при использовании в качестве поддерживающей среды различ­ных гелей, нагревание является существенной проблемой. Для минимизации вы­деления тепла в средах этого типа обычно используются источники, поддержи­вающие постоянную силу тока.

Время. Длина миграции непосредственно зависит от времени, в течение ко­торого протекает электрофоретический процесс. Другие факторы, влияющие на миграцию, включают в себя явления электроосмоса и хроматографии, форму час­тиц, «барьерный» эффект, «фитильный поток» и потенциал течения.

Типы поддерживающих сред. В различных приложениях электрофоретиче-ских методик используется широкое разнообразие поддерживающих сред. В их числе — бумага, ацетат целлюлозы, крахмальный гель, агаровый гель, акриламидный гель и сахароза. Здесь мы обсудим электрофорез на ацетате целлюлозы, по­скольку этот метод широко применяется в клинических лабораториях, и его общий принцип подходит и для других поддерживающих сред.

Пленки из ацетата целлюлозы имеют ряд преимуществ перед фильтровальной бумагой, которая изначально использовалась в качестве поддерживающей среды для электрофореза.

На рис. 11.9 представлена схема устройства для электрофореза на ацетате цел­люлозы. Полоска ацетата целлюлозы пропитывается буферным раствором и уста­навливается в держатель мембраны («мостик»), «Мостик» устанавливается в «кю­вету», при этом оба конца полоски погружаются в отсеки с буферным раствором.

На одной полоске можно одновременно разделять несколько (обычно восемь) образцов. Каждый образец наносится на полоску в отмеченной точке. Далее на полоску подается электрическое напряжение. Для данного типа электрофореза обычно используются источники тока, поддерживающие постоянное значение на­пряжения. Типичная величина напряжения составляет 250 В, что соответствует начальной силе тока 4—6 мА. Как уже говорилось, в ходе процесса сила тока не­много увеличивается. Через 15—20 мин, в зависимости от типа прибора, подача напряжения отключается. Следующим этапом является фиксация на мембране полосок, соответствующих зонам миграции белков, и окрашивание, позволяющее их увидеть, а также осуществить количественный анализ. Это можно сделать пу­тем последовательной или одновременной обработки мембраны фиксирующим реагентом и красителем. Затем мембрана «осветляется», чтобы сделать ее про­зрачной. При этом остаются неосветленные области, содержащие связанные с красителем частицы. Далее мембрана высушивается для подготовки к денситометрическому анализу.

Денситометр — это прибор, включающий в себя источник света, фильтр и детектор (обычно фотодиодный).

Мембрана устанавливается в держатель денситометра. Затем производится сканирование вдоль пути миграции одного из образцов. Низковольтный выходной сигнал детектора усиливается стабилизированным аналоговым предусилителем. Сигнал от предусилителя подается на аналоговый двухкоординатный самописец и на аналоговый интегратор. Двухкоординатный самописец стоит график, на котором по оси х откладывается длина миграции, а по оси у — плотность мембраны (которая прямо пропорциональна количеству компонента образца, мигрировавшего на соот­ветствующую длину). Интегратор имеет схему, которая регистрирует начало и конец каждого выраженного пика и вычисляет площадь этого пика. Численные значения площадей печатаются на электрофореграмме рядом с соответствующими пиками. Эта процедура повторяется для каждого из образцов на мембране,

Рис. 11.9 Электрофорез на ацетате целлюлозы.

Рис. 11.10 Примеры электрофореграмм белков сыворотки. Картина разделения, показанная слева, соответствует норме. Картина, показанная справа, наблюдается при избыточном продуцировании гамма-глобулина.

Автоматические химические анализаторы

Рассмотрим два важнейших типа автоматических химических анализаторов. Это Синхрон СХ4 (Synchron CX4) производства Beckman, и Клини ческий Автоанализатор (АКА) производства DuPont. Оба эти прибора значительно увеличивают производительность клинической лаборатории и уменьшают время получения результата при экстренных запросах (так называемые экстренные за­просы 57/47). Синхрон СХ4 является сравнительно новым прибором, АКА — бо­лее старым, но широко используемым. В обеих системах для проведения основ­ных измерений используются спектрофотометрические методы. Приборы отли­чаются способами выполнения этапов отбора образца, разбавления, смешива­ния образца с реагентами, физического перемещения образца, обсчета и регист­рации результатов. ,ницй мэкуЭ иМ .RiiKSiiiBqa вг-.нки ечгм'лр-шшшв п вкмгртнн спои СИНХРОН СХ4 .; _:а\эоп гэасня 08 ~н кё!\жб/< ;not-j<jc-!>: ноньо э эщикдохэноцп

pqna-ruH От^чЛчЖУГ, ч имчпя ,1.4 ЧМНР.ЯООМТТ}Т Г.П.ХН11 ИП6Т€

Система Синхрон СХ4 (Synchron CX4) является современным высокопроизводи­тельным химическим анализатором (Anonymous, 1989). Это клинический анализа­тор с произвольным порядком выполнения операций способен выполнять широкий набор тестов в одном запуске. Он имеет ряд возможностей, представляющих инте­рес с точки зрения перспектив биомедицинской технологии. Эти возможности включают в себя автоматическое манипулирование образцом, применение целого ряда аналитических методик, широкое использование микрокомпьютеров и прин­ципы идентификации по штрих-коду. Этот прибор является химическим анализа­тором с произвольным порядком действия, контролируемым микрокомпьютером. Он проводит анализ конечных результатов и выполняет кинетические тесты (при 30 С или при 37 С). ._M,,_nn,_{JN хнннэюы},.,_Ыа хите Н ^атээи: •>» отомзт.^ ,;n.EHS HHimqr Рабочие характеристики. Оператор управляет работой прибора СХ4 с помо­щью монитора и клавиатуры. Доступ к иерархической системе рабочих окон осу­ществляется с помощью восьми функциональных клавиш. (Назначение каждой клавиши отображается в нижней части экрана.) Основными являются пять функ­ций: программирование образцов, загрузка реагентов, калибровка, специальные функции и параметры системы. _{ю ra}'_{<HHOHUJfR3q н} аотнэтеео иопЛ :aomeqOo дагю :им

1. Программирование образцов. С помощью этой функции оператор может обозначить материал, содержащийся в определенной чашке, как анализируе­мый или контрольный образец, ввести информацию для идентификации мате­риала, и указать, каким тестам этот материал должен быть подвергнут. Преду­смотрены специальные процедуры, позволяющие провести экстренный ана­лиз образцов. С помощью системного принтера можно получить список типов материала, который предполагается поместить в каждую из чашек в секторе образцов (список загрузки). Характеристики сектора образцов будут обсуж­даться ниже. Этот список используется при размещении в секторе полученных от пациентов и контрольных образцов.

2. Загрузка реагентов. Эта процедура позволяет оператору вставлять, извле­кать и заменять патроны с реагентами в 24 гнездах на барабане реагентов. Каждый патрон с реагентами имеет этикетку со штрих-кодом, содержащим полную информацию о нем, включая тип теста, в котором он используется, и его срок годности. Считывающее устройство снимает информацию со штрих-кода при установке или извлечении патрона из барабана, и эта информация передается главному процессору системы.

3. Калибровка. Для обеспечения точности и надежности измерения используют­ся материалы с известными концентрациями анализируемых веществ (стандартные образцы). Калибровка осуществляется как в момент загрузки реаген­тов в систему, так и через определенные промежутки времени.

4. Специальные функции. Эти функции включают в себя установку и настройку системы, диагностику системы и процедуры обслуживания системы.

5. Параметры системы. В этом режиме оператор может контролировать теку­щее рабочее состояние прибора, текущую конфигурацию системы (например, , типы активных тестов), и показания различных датчиков прибора (например, тэгтемпературы и уровни жидкостей).

Принцип работы. Цикл тестирования состоит из двух типов процессов: служеб­ного интервала и аналитического цикла вращения. Мы будем обсуждать события, происходящие с одной кюветой; каждая из 80 кювет последовательно проходит эти этапы цикла тестирования. Во время служебного интервала (10 секунд) инициали­зируется химическая реакция теста. Этот процесс включает в себя удаление из кю­веты продуктов реакции от предыдущего теста, и внесение в кювету реагентов тес­та и тестируемого образца (полученного от пациента или контрольного). Во время аналитического цикла барабан с образцом вращается со скоростью 90 об/мин в течение 6 секунд. Кювета проходит через оптический блок, в котором производят­ся измерения оптического поглощения на пяти частотах.

В тестах конечной точки для вычисления концентрации анализируемого веще­ства используются результаты последнего из измерений оптического поглощения продуктов реакции. В тестах кинетического типа используется тот факт, что ско­рость изменения оптического поглощения в реакционной смеси зависит от концен­трации анализируемого вещества. В этих вычислениях используются данные изме­рений, относящихся к наиболее линейному участку кинетической кривой реакции.

Процедура анализа данных включает в себя вычисление концентрации анали­зируемого вещества по показаниям оптического поглощения. Каждая из этих концепций будет обсуждаться ниже более подробно.

Описание системы. Система СХ4 включает в себя три основные подсистемы: блок образцов, блок реагентов и реакционную систему.

Блок образцов Блок образцов состоит из пяти модулей: секторы образцов (до восьми), система автоматической загрузки, поворотный стол для образцов, пробоотборник-смеситель, и чашка для промывки пробоотборника-смесителя. Сектор образцов может нести до десяти чашек с образцами, полу­ченными от пациентов, либо с контрольными образцами. Оператор вводит информацию, идентифицирующую материал в каждой из чашек, с помощью компьютерной системы управления (выше). Система автоматической загрузки переносит секторы с образцами на барабан образцов под управлением микро­компьютера. В этом процессе используются шаговый двигатель и пневмогидравлическая система. По завершении цикла тестирования сектор аналогич­ным образом снимается с барабана. Поворотный стол для образцов состоит из барабана образцов и оптического считывающего устройства. Барабан образ­цов является поворотным устройством с дискретными положениями, и приво­дится в движение шаговым двигателем. Управление поворотами осуществля­ется микрокомпьютером таким образом, чтобы анализируемый материал был доступен для пробоотборника. Пробоотборник имеет датчик уровня жидкости, что позволяет ему погружать иглу пробника на правильную глубину, обеспе­чивая тем самым возможность отбора правильного количества анализируемого материала. После того, как анализируемый материал попадает в пробоотборник, крановая система поворачивает пробоотборник в такое положение, чтобы игла пробника находилась над кюветой на реакционном барабане. За­тем материал сливается в кювету.

2. Блок реагентов Блок реагентов включает в себя патроны с реагентами, ба­рабан реагентов и дозатор реагентов. Патроны с реагентами являются однора­зовыми емкостями, в которых содержатся реагенты, необходимые для опреде­ленного теста. Они имеют этикетки со штрих-кодом, указывающим тест, в ко­тором они используются. Барабан реагентов вращается под управлением мик­рокомпьютера, подавая нужный реагент к дозатору. Барабан реагентов несет 24 патрона.

3. Реакционная система Реакционная система включает в себя реакционный барабан и фотометрический блок. Реакционный барабан несет 80 кювет, в ко­торых протекают химические реакции. В кюветах поддерживается постоянная температура в 30°С, либо 37°С. Фотометрический блок состоит из ксеноновой лампы, коллиматорной системы, оптических фильтров и фотодиодных детек­торов. Ксеноновая лампа выдает вспышку света всякий раз, когда кювета про­ходит через оптический блок. Вследствие того, что вспышки имеют перемен­ную интенсивность, используется система коррекции вспышек. Эта система основана на проведении измерений поглощения на частотах, отличных от ос­новной частоты измерения. Свет, прошедший через кювету с образцом, попа­дает в коллиматорную систему, которая разделяет его на лучи, направленные через каждый из десяти фильтров (340, 380, 410, 470, 520, 560, 600, 650, 670 и 700 нм) на десять фотодиодных детекторов. Каждый из детекторов выдает сигнал, пропорциональный интенсивности падающего на него света. Сигналы проходят через логарифмическую цепь усиления и подаются на вход коммута­тора. Коммутатор, управляемый микрокомпьютером, в определенные момен­ты производит замер сигнала, и передает аналоговый сигнал на аналогово-цифровой преобразователь. Данные измерений поглощения в цифровом пред­ставлении передаются центральному процессору системы.

Для большинства тестов при вычислении результатов используются данные измерения поглощения лишь на пяти из десяти возможных частот. В течение каж­дого цикла вращения каждая из кювет проходит через оптический блок восемь раз. Число циклов вращения зависит от типа теста. Например, при определении глю­козы от момента добавления образца к реагенту до окончания реакции проходит около 200 секунд. Поскольку цикл вращения повторяется каждые 16 секунд, для этого теста требуются 13 циклов вращения. Для каждого цикла вращения по его завершении вычисляется среднее значение величины поглощения. После окончания реакции выполняется кубическая интерполяция по средним значениям поглощения. Этот процесс также выполняет функцию цифрового фильтра, уменьшаю­щего величину шума. Как показано на рис. 11.4, эта процедура выполняется в течение того периода, когда в кювете присутствует только реагент для определения фонового поглощения, а также после добавления образца. Кривая поглощения, показанная на рис. 11.4, характерна для тестов, в которых производятся измере­ния кинетического типа. В тестах конечной точки, наоборот, данные измерения по­глощения считываются после завершения реакции, и кривая поглощения выходит на горизонталь. Конечная концентрация анализируемого вещества вычисляется по закону Бэра. Результаты теста распечатываются в форме отчета, который можно вложить в медицинскую карту пациента и передать его лечащему врачу. Прибор имеет последовательный компьютерный порт для пересылки результатов измере­ний на лабораторный компьютер.

Рис. 11.4 Синхрон СХ4. Окно считывания результатов для измерений кинетического типа.