Тема шестая превращение веществ в растениях

В целом обмен веществ - совокупность огромного числа физических и биохимических реакций, объединенных в пространстве и во времени в единое и упорядоченное целое, подчиняющееся законам термодинамики и обеспечивающее жизнедеятельность растения.

Работа 17. Получение амилазы из солода и обнаружение ее действия

ХОД РАБОТЫ

Половину чайной ложки солода растирают в ступке, приливают около 20 мл теплой воды, смесь взбалтывают и оставляют на 10 минут. Затем отфильтровывают через бумажный фильтр в коническую колбу. Первые порции мутного фильтрата сливают обратно на фильтр. В фильтрат перейдет фермент амилаза, расщепляющий крахмал.

Наиболее чувствительной цветной реакцией на крахмал и продукты его гидролиза является йодная проба. Для обнаружения действия амилазы берут слабый раствор йода, который готовят следующим образом: небольшое количество концентрированного раствора йода в йодистом калии приливают в колбочку и разбавляют дистиллированной водой до появления светло-желтой окраски. Приготовленный раствор разливают в два ряда пробирок (всего 20-24) по 5 мл. Берут 2 конические колбочки, наливают в них по 30 мл раствора крахмала, добавляют по 5 мл отфильтрованной солодовой вытяжки с амилазой. Одну колбочку оставляют на столе при комнатной температуре, а другую помещают в водяную баню, нагретую до 55°С. Во избежание разрушения фермента не следует допускать перегрева бани.

В первую пробирку каждого ряда приливают 1 мл через каждые 2 минуты и вносят в очередную пробирку с раствором йода соответствующего ряда. Йод будет окрашивать крахмал и продукты его гидролиза в разные цвета: в типично синий, характерный для неизмененного крахмала, затем в сине-фиолетовый и темно-фиолетовый (амилодекстрины), красно-бурый (эритродекстрины) и желтый (ахродекстрины). Получается как бы цветная шкала постепенного гидролиза крахмала.

Когда внесенная проба (1 мл) уже не будет изменять светло-желтой окраской йода, это указывает на окончание гидролиза крахмала, из колбочки берут 2 мл раствора, переносят в пробирку и добавляют такое же количество фелинговой жидкости. Образование кирпичного красного осадка закиси меди после кипячения содержимого пробирки свидетельствует о присутствии низкомолекулярных восстанавливающих (редуцирующих) сахаров в испытуемом растворе появившихся в результате гидролиза крахмала.

Аналогичную реакцию проводят с исходным крахмалом. Время окончания его гидролиза в первой и во второй колбочках дает возможность судить о скорости процессов при разных температурах. Результаты опыта учитывают по схеме:

Условия опыта	Окраска раствора йода в пробирках										Начало опыта	Окончание опыта	Время гидролиза
	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
Комнатная температура
Температура 55°С

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) солод; 2) 2%-ный раствор крахмала; 3) раствор йода в йодистом калии; 4) пипетки на 1 мл, 20 мл; 5) термометр; 6) штатив с пробирками; 7) воронки; 8) фильтры; 9) жидкость Фелинга; 10) водяная баня.

Работа 18. Выделение β-фруктофуранозидазы из дрожжей и ферментативный гидролиз сахарозы

Данный фермент (прежнее название инвертаза или сахараза) разлагает сахарозу на фруктозу и глюкозу (инвертный сахар):

С₁₂Н₂₂О₁₁ + Н₂О = С₆Н₁₂О₆ + С₆Н₁₂О₆

сахароза глюкоза фруктоза

ХОД РАБОТЫ

2-3 г прессованных дрожжей смешивают с 2-3 г кварцевого песка, доливают 5 мл воды и тщательно растирают в фарфоровой ступке. Затем приливают еще 15 мл воды, нагретой до 40°С, и продолжают растирание в течение 10 минут. Раствор профильтровывают через складчатый фильтр. Первые порции мутного фильтрата сливают снова на фильтр. На фильтре будет находиться β-фруктофуранозидаза, расщепляющая сахарозу на глюкозу и фруктозу.

В три пробирки помещают по 5 мл 2%-ного раствора сахарозы. Одну оставляют для контроля, во вторую приливают 1 мл фильтрата, в третью также 1 мл фильтрата, но предварительно прокипяченного. Пробирки ставят в водяную баню с температурой 40°С. Через 15-20 минут в них добавляют 5 мл реактива Фелинга, а затем содержимое следует хорошо прокипятить на горелке. В присутствии восстанавливающих сахароз выпадает кирпично-красный осадок закиси меди (Сu₂О).

На основании результатов реакции делают заключение о действии фермента β-фруктофуранозидазы и о влиянии на его активность высокой температуры.

Результаты записывают по схеме:

Вариант	Состав смеси в пробирке, мл			Результат
	сахароза, 2%-ный р-р	фильтрат - носитель фермента
		без кипячения	после кипячения
1	5	-	-
2	5	1	-
3	5	-	1

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) дрожжи прессованные; 2) ступка; 3) кварцевый песок; 4) воронки; 5) штатив с пробирками; 6) водяная баня; 7) 2%-ный раствор сахарозы; 8) реактив Фелинга; 9) пипетки; 10) фильтровальная бумага.

Работа 19. Определение активности липаз в процессе прорастания семян

При прорастании семян масличных растений, отличающихся высоким содержанием триглицеридов, отмечается быстрое уменьшение содержания жиров и одновременно увеличивается концентрация сахарозы. Образование углеводов из жиров - многоэтапный процесс, четко разграниченный в пространстве и во времени. С момента начала набухания семян масличных культур первым ферментом, атакующим молекулу жира (триглицерида), является нейтральная липаза. Установлено, например, что в семенах клещевины эта липаза активируется одной из протеиназ, присутствующих в эндосперме.

Липаза ступенчато гидролизует триглицерид до диглицерида, моноглицерида и, наконец, до свободного глицерина и жирных кислот.

Липазы, присутствующие в семенах масличных растений, проявляют активность при различных значения рН. Поэтому иногда употребляют названия нейтральной, кислой и щелочной липазы. Наиболее активными в семенах масличных является кислая и щелочная липазы. Определение их активности основано на учете концентрации жирных кислот, образующихся при действии на чистый препарат какого-либо жира (масла) экстрактом липаз, выделенным из семян разных периодов проращивания.

ХОД РАБОТЫ

Для навески очищенных от кожуры прорастающих семян подсолнечника (по 3 г каждая) помещают в фарфоровые ступки, приливают по 1 мл чистого подсолнечного масла и тщательно растирают в течение 3-4 минут. Затем в одну из ступок приливают 6 мл ацетатного буфера с рН=4,7, а в другую - 5 мл боратного буфера с рН=8,5 и продолжают растирание в течение 2 минут. Затем содержимое ступок количественно переносят в две конические колбы емкостью 100 мл. Ступку и пестик ополаскивают 5 мл воды, сливая промывные воды в соответствующую колбу, добавляют по 5 капель толуола, плотно закрывают пробками и ставят на ротатор, где перемешивают в течение 30 минут. После этого колбы ставят на 20 часов в термостат, нагретый до 30 °С.

Одновременно готовят две контрольные пробы (для каждого рН), с которым проделывают те же операции, что и при исследовании образцов, однако перед помещением контрольных колб в термостат их содержимое кипятят 5-10 минут на электроплитке для инактивации липаз.

Через 20 часов (на следующий день) колбы вынимают из термостата, приливают в каждую из них по 50 мл смеси этилового спирта с эфиром в соотношении 4:1, встряхивают и дают несколько минут отстояться. Далее добавляют по 4-5 капель тимолфталеина и содержимое колб титруют 0,1 н спиртовым раствором NaOH. Активность кислых и щелочных липаз выражают в миллилитрах 0,1 н NaOH, пошедшей на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся в результате действия липаз на 1 г семян.

Результаты рассчитывают по формуле:

где АЛ - активность липазы (кислой или щелочной);

а и в - количество 0,1 н NaOH, затраченное на титрование опытного и контрольного образцов, мл;

Т - поправка к титру 0,1 н раствора NaOH;

Н - навеска семян, г.

Заполняют таблицу:

№ п/п	Объект исследования, рН	Навеска материала, (Н),г	Пошло на титрование 0,1 н р-ра NaOH, мл		Активность липазы (АЛ), мл 0,1н NaOH/г
			исследуе­мого р-ра (а)	контроль­ного р-ра (в)
1
2
3
4

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) семена подсолнечника, отобранные в различные периоды прорастания; 2) ацетатный буфер с рН=4,7; 3) боратный буфер с рН=8,5; 4) подсолнечное масло; 5) 0,1 н спиртовой раствор NaOH; 6) смесь этилового спирта с эфиром (4:1); 7) толуол; 8) 1%-ный спиртовый раствор тимолфталеина; 9) фарфоровые ступки с пестиком; 10) конические колбы на 100 мл; 11) мерные цилиндры на 10 и 50 шт.; 12) ротатор; 13) аналитические весы; 14) термостат; 15) электроплитка.

Работа 20. Превращение запасных веществ при прорастании семян

ХОД РАБОТЫ

Растереть в четырех ступках непроросшие и проросшие семена - крахмалистые (пшеница) и маслянистые (клещевина). Маслянистые семена перед измельчением желательно очистить от кожуры. Поместить материал в разные пробирки, залить небольшим количеством воды, нагреть в кипящей водяной бане. Слить вытяжки в чистые пробирки, прилить равный объем реактива Фелинга и довести до кипения.

По количеству образовавшейся закиси меди дать оценку содержания редуцирующих сахаров. К оставшемуся в пробирках материалу (мезге) прилить раствор йода и по интенсивности посинения дать оценку содержания крахмала.

Сделать тонкие срезы непроросших и проросших маслянистых семян, поместить на предметные стекла в капли раствора Судан III, закрыв покровными стеклами.

Через 5 минут промыть срезы водой, рассмотреть в микроскоп и дать оценку содержания жира - по количеству и размерам капель, окрашенных в красный или оранжевый цвет.

Нанести в капли на предметные стекла небольшое количество эндосперма непроросших и проросших семян пшеницы (не подвергавшихся нагреванию), рассмотреть в микроскоп и зарисовать крахмальные зерна.

Результаты записать в таблицу, оценивая содержание соответствующих веществ в баллах.

Семена	Крахмал	Жир	Редуцирующие сахара
Крахмалистые непроросшие
Крахмалистые проросшие
Маслянистые непроросшие
Маслянистые проросшие

Сделать выводы о превращении веществ при прорастании крахмалистых и маслянистых семян.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) семена различных растений (сухие и проросшие); 2) фильтровальная бумага; 3) краситель Судан III; 4) реактив Фелинга; 5) водяная баня; 6) йод в йодистом калии.

Пётр Арамаисович Иконников

Анна Алексеевна Белозёрова