С. Н. ЩЕЛКУНОВ

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ

2-е издание, исправленное и дополненное

Рекомендовано Министерством образования Российской Федерации в качестве учебного пособия для студентов высших учебных заведений, обучающихся по направлению «Биология» и специальностям «Биотехнология», «Биохимия», «Генетика», «Микробиология»

СИБИРСКОЕ УНИВЕРСИТЕТСКОЕ ИЗДАТЕЛЬСТВО НОВОСИБИРСК• 2004

УДК 575/578 ББК Е041.15 Щ45

Издание осуществлено при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (издательский проект № 03-04-62013)

Рекомендовано к печати

Ученым советом Новосибирского государственного университета

Рецензенты:

Кафедра молекулярной биологии Новосибирского государственного университета, академик РАН, профессор В. В. Власов

Кафедра генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета, академик РАН, профессор С. Г. Инге-Вечтомов

Директор Института молекулярной генетики РАН, академик РАН, профессор Е. Д. Свердлов

Ректор Пущинского государственного университета, чл.-корр. РАН, профессор А. М. Воронин

Заведующий кафедрой физиологии растений и клеточной биологии

Иркутского государственного университета, чл.-корр. РАН, профессор Р. К. Саляев

Щелкунов С. Н.

Щ45 Генетическая инженерия: Учеб.-справ, пособие. — 2-е изд., испр. и доп. — Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2004. — 496 с; ил. ISBN 5-94087-098-8

Первое отечественное учебно-справочное пособие, в котором подробно и доход­чиво рассмотрены основные понятия и методы генетической инженерии. В книге на большом числе примеров дан критический анализ подходов к клонированию и экс­прессии чужеродных генов в клетках грамотрицательных и грамположительных бакте­рий, дрожжах и клетках высших эукариот. Пособие подготовлено на основе лекций, читаемых автором в Новосибирском государственном университете с 1980 г.

В новое издание введены главы, посвященные трансгенным животным и расте­ниям, современным подходам к созданию эффективных противовирусных вакцин, значительно дополнены разделы по белковой инженерии, расшифровке нуклеотидных последовательностей ДНК, использованию полимеразной цепной реакции в фунда­ментальных и прикладных исследованиях.

Большое число рисунков и таблиц значительно облегчают понимание весьма слож­ного материала. В каждой главе приведен список литературы.

Издание рассчитано на студентов, аспирантов и преподавателей биологических и химических факультетов вузов, а также научных сотрудников, работающих в области молекулярной биологии, генетики, биохимии, микробиологии и биотехнологии.

УДК 575/578 ББК Е041.15

ISBN 5-94087-098-8

О Щелкунов С. Н., 2004

© Сибирское университетское издательство, 2004

ОГЛАВЛЕНИЕ

Предисловие 7

Глава I. Общие принципы и методы

генетической инженерии 9

1. Строение и свойства молекулы ДНК 10

2. Ферменты генетической инженерии 12

1. Рестриктазы 13

2. ДНК-лигаза 22

3. ДНК-полимераза I E. coli 23

4. Обратная транскриптаза 25

5. Нуклеаза Ваl31 27

6. Концевая дезоксинуклеотидил- трансфераза 27

7. Поли(А)-полимераза E. coli 28

1.3. Методы конструирования гибридных молекул ДНК in vitro 28

1. Коннекторный метод 28

2. Рестриктазно-лигазный метод 29

4. Векторные молекулы ДНК 31

5. Введение молекул ДНК в клетки 32

6. Методы отбора гибридных клонов 34

1. Фенотипическая селекция 34

2. Гибридизация нуклеиновых кислот

in situ 34

3. Функциональная комплементация . ... 35

4. Радиоиммуноанализ белков in situ .... 35

1.7. Расшифровка нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК.... 36

1. «Плюс-минус»-метод 36

2. Метод Сэнгера 38

3. Метод Максама-Гилберта 38

4. Автоматическое секвенирование ДНК. . 42

5. Базы данных нуклеотидных

и аминокислотных последователь­ ностей 44

1.7.6. Геномные проекты 45

1.8. Амплификация последовательностей ДНК

in vitro 48

1. Полимеразная цепная реакция 48

2. Примеры использования ПЦР 51

1.9. Блоттинг по Саузерну 56

10. Иммуноблоттинг 57

11. Разделение электрофорезом гигантских молекул ДНК 58

12. Методы химико-ферментативного синтеза двухцепочечных фрагментов ДНК

(А. Н. Синяков) 59

1. Метод Кораны 59

1. Конструирование ДНК-дуплексов из частично комплементарных полинуклеотидов 72

2. Конструирование искусственных генов

из сверхдлинных полинуклеотидов . . 74

1.12.4. Использование для синтеза генов полимеразной цепной реакции 75

Глава 2. Векторная система грамотрицательной бактерии Escherichia coli 80

2.1. Введение плазмидных и фаговых молекул ДНК в клетки Е. coli 80

1. Строение клеточной стенки грамотрицательных бактерий 80

2. Сферопласты 83

3. «Кальциевые» компетентные клетки. . . 83

4. Электропорация 84

5. Упаковка ДНК фага лямбда в капсиды

in vitro 84

2.2. Молекулярные векторы Е. coli 85

1. Клонирующие плазмидные векторы . . . 85

2. Молекулярные векторы на основе

ДНК фага лямбда 97

3. Космиды 105

4. Искусственные бактериальные хромосомы 107

5. Фазмиды 109

6. Клонирующие векторы на основе нитевидных фагов 110

7. Фагмиды 118

8. Векторные плазмиды, обеспечивающие прямой отбор гибридных ДНК 118

9. Векторы, обеспечивающие экспрессию чужеродных генов в клетках Е. coli. . . 121

2.2.10. Векторы Е. coli, детерминирующие секрецию чужеродных белков 130

ОГЛАВЛЕНИЕ

Глава 3. Достижение повышенной продукции белков, кодируемых генами, клониро­ванными в клетках Escherichia coli. ... 139

1. Эффект дозы гена при молекулярном клонировании 139

2. Влияние эффективности транскрипции клонированных генов на уровень

их экспрессии 142

3.3. Повышение эффективности трансляции

матричных РНК 148

3.4. Стабилизация чужеродных мРНК

и белков в клетках Е. coli 1S2

Глава 4. Экспрессия клонированных эукариотических генов в клетках Escherichia coli 157

4.1. Сравнительный анализ организации

и реализации генетической информации

у прокариот и эукариот 157

2. Экспрессия хромосомных эукариотиче­ ских генов в клетках Е. coli 158

3. Клонирование ДНК-копий эукариотических матричных РНК и их экспрессия в клетках E.coli 161

4. Экспрессия в Е. coli химико-ферментативно синтезированных ген-эквивалентов эукариотических полипептидов 163

Глава 5. Конструирование штаммов — продуцентов первичных метаболитов на основе Escherichia coli 167

Глава 6. Направленный мутагенез молекул

ДНК in vitro 171

1. Генно-инженерные делеции и вставки последовательностей ДНК 172

1. Статистический мутагенез гибридных

ДНК 173

6.3. Сегмент-направленный мутагенез

in vitro 175

6.4. Олигонуклеотид-направленный мутагенез

in vitro 180

Глава 7. Белковая инженерия 187

1. Получение новых форм белков олигонуклеотид-направленным мутагенезом 187

2. Изучение доменной структуры белков . . . 190

3. Создание белков с гибридными свойствами 191

4. Иммунотоксины 195

7.5. Фаговый дисплей 196

7.5.1. Принцип метода 196

2. Дептидные фаговые библиотеки .... 198

3. Фаговый дисплей белков 199

4. Направленная эволюция белков 200

5. Фаговый дисплей антител 200

Глава 8. Стабильность гибридных молекул

ДНК в клетках Escherichia coli 204

Глава 9. Векторные системы

грамотрицательных бактерий,

не относящихся к роду Escherichia .... 211

1. Плазмиды широкого круга хозяев 211

1. Молекулярные векторы на основе плазмид группы несовместимости IncQ 216

2. Молекулярные векторы на основе плазмид группы несовместимости IncP 225

3. Использование векторов широкого круга хозяев для молекулярно-генетических исследований грамотрицательных бактерий 228

4. Бифункциональные (челночные) векторные плазмиды 229

Глава 10. Генно-инженерная система грамположительных бактерий рода Bacillus 233

10.1. Введение молекул ДНК в клетки

Bacillus 234

1. Строение клеточной стенки грамположительных бактерий 234

2. Трансформация компетентных

клеток 234

3. Универсальные методы введения плазмид 238

4. Трансфекция 239

10.2. Молекулярные векторы Bacillus 240

10.2.1.Клонирующие векторы на основе плазмид стафилококков

и стрептококков 240

2. Векторы на основе плазмид Bacillus . 246

3. Векторные плазмиды, реплицирую­ щиеся в В. subtilis и в Е. coli 249

4. Векторная система секреции чужеродных белков из клеток

Bacillus 250

5. Плазмидные интегративные векторы . 257

6. Фаговые векторы 260

10.3. Экспрессия чужеродных генов в клетках Bacillus 262

10.3.1. Особенности строения и экспрессии генов грамположительных

бактерий 262

10.3.2. Оптимизация экспрессии клонированных генов 265

10.4. Стабильность плазмид в клетках

В. subtilis 267

ОГЛАВЛЕНИЕ