лекции по микробиологи / Микобактерии

Микобактерии.

В состав рода Mycobacterium семейства Mycobacteriaceae включены кислото- и спиртоустойчивые аэробные неподвижные грам-положительные прямые или изогнутые палочковидные бактерии. Иногда они образуют нитевидные или мицелиальные структуры. Характерно высокое содержание липидов и восков (до 60%). Каталаза- и арилсульфатаза-положительны, резистентны к действию лизоцима. Растут медленно или очень медленно.

Микобактерии широко распространены в окружающей среде – воде, почве, на растениях и животных.

По признаку патогенности выделяют собственно патогенные, вызывающие конкретные заболевания (5 групп- М. Tuberculosis, M. leprae, M.bovis, M. Miccroti, M. Lepraemurium) и атипичные микобактерии.

Патогенные микобактерии.

Mycobacterium Tuberculosis (палочка Коха). Возбудитель туберкулеза человека- хронического инфекционного заболевания, характеризующегося поражениями органов дыхания, костей, суставов, кожи, мочеполовых и некоторых других органов. Заболевание известно с глубокой древности. Легочная форма туберкулеза описана античными авторами ( Артеем Каппадокийским, Гиппократом и др.) Однпко древние ввторы не рассматривали его как инфекцию, Ибн-Сина считал его наследственной болезнью. Первым прямо указал на его инфекционную природу Фракасторо, а Сильвий отметил связь легочных бугорков с чахоткой. Многообразие клинических проявлений туберкулеза обуславливало много ошибочных представлений: де Лааэнек относил легочные бугорки к злокачественным новообразованиям, Вирхов не связывал казеозный некроз с туберкулезным процессом. Рост городов, скученность населения и низкий санитарный уровень жизни привели к тому, что в 18-19 вв. туберкулез собирал обильную жатву среди разных слоев населения: достаточно вспомнить Моцарта, Шопена, Некрасова, Чехова и др.

Инфекционная природа заболевания была доказана Вильменом (1865), а важнейшим этапом в изучении и совершенствовании мер борьбы с туберкулезом стало короткое сообщение Коха на заседании берлинского физиологического общества 24 марта 1882 года об этиологии туберкулеза, в котором он изложил основные постулаты-критерии для оценки патогенности любого микроорганизма.

1. Эпидемиология. Резервуар Mycobacterium Tuberculosis - больной человек, основной путь заражения- аэрогенный, реже через кожу и слизистые оболочки. В редких случаях возможно трансплацентарное инфицирование плода.

а) Проникновение микобактерий далеко не всегда вызывает развитие патологического процессса,особую роль играют неблагоприятные условия жизни и трудовой деятельности. В настоящее время наблюдается рост заболеваемости, что связано с очевидным снижением уровня жизни населения и сопутствующим дисбалансом в питании с одной стороны, и усиливается «активность» возбудителя, обусловленная , очевидно, вытеснением естественных конкурентов в результате применения антимикробных средств.

б) Не меньшее значение имеют «старение» населения во всем мире и увеличение количества лиц с хроническими заболеваниями, сопровождающимися нарушениями иммунитета.

в) особую роль в инфицировании Mycobacterium Tuberculosis играет скученность населения: в РФ – следственные изоляторы, лагеря беженцев, лиц «бомж».

2. Морфология и тинкториальные свойства.

Тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки размером 1-10 * 0,2-0,6 мкм, со слегка изогнутыми концами, в цитоплазме содержат зернистые образования. Морфология варьирует в зависимости от возраста культуры и условий культивирования – в молодых культурах палочки более длинные, а в старых склонны к простому ветвлению. Иногда образуют кокковидные структуры и L-формы, сохраняющие инфекциозность, а также фильтрующиеся формы.

Неподвижны, спор не образуют, лишены капсул, но имеют микрокапсулу, отделенную от клеточной стенки осмиефобной зоной. Кислотоустойчивы, что обусловлено высоким содержанием липидов и миколовой кислоты в клеточной стенке, а также образуют кислотостабильные гранулы, преимущественно состоящие из метафосфата (зерна Муха), располагающиеся свободно либо цитоплазме палочек.

Грамположительны, анилиновые красители воспринимают плохо, по Цилю-Нильсену окрашиваются в ярко-красный цвет, по Муху- Вайссу – в фиолетовый( йодофильность).

3. Культуральные свойства. Аэробы, но способны расти в факультативно анаэробных условиях, 5-10% содержание СО2 способствует более быстрому росту. Размножаются делением, процесс происходит очень медленно, в среднем за 14-18 часов. Температурный оптимум 37-38 гр.С, рН 7,0-7,2

(растет в пределах 4,5 –8,0).

Для роста нуждается в присутствии белкового субстрата и глицерина, а также углерода, хлора, фосфора, азота, факторов роста (биотина, никотиновой кислоты, рибофлавина), ионов (Mg, K, Na, Fe ).

Для выращивания используют плотные яичные среды ( Левинштайна-Йенсена, Петраньяни, Досе), синтетические и полусинтетические жидкие среды (среда Сотона). На жидких средах рост наблюдают на 5-7 сутки в виде сухой морщинистойй пленки (R - форма), поднимающейся на края пробирки, среда остается прозрачной. В средах, содержащих детергент (твин-80) дают равномерный рост по толще среды. На жидких средах и при внутриклеточном развитии хорошо выявляется характерный корд-фактор (трегалоза-6,6-димиколат), обуславливающий сближение бактериальных клеток в микроколониях, их рост в виде серпантинообразных кос и имеющий отношение к вирулентности возбудителя. На плотных средах рост отмечают на 14- 40 сутки в виде сухого морщинистого налета кремового цвета, колонии с приподнятым центром, напоминающие цветную капусту, крошковатые, плохо смачиваются водой и имеют приятный аромат. Культуры плохо снимаются со среды, а при прокалывании трещат. Под влиянием антибактериальных препаратов могут дисссоциировать с образованием мягких влажных S- колоний либо расти в виде гладких или пигментированных колоний. Отличительная особенность Mycobacterium Tuberculosis – ссрособность к синтезу значительного количества никотиновой кислоты ( ниацина), что используют для ее дифференциальной диагностики с прочими микобактериями ( ниациновый тест), одно из условий- - необходимость посева на среду Левинштайна-Йенсена, не содержащую малахитовый зеленый) т.к. краситель вступает в реакцию с используемыми реагентами). На средах с желчью образует сероватый, маслянистый налет, образованный удлиненными ветвящимися палочками.

4. Палочка Коха достаточно устойчива к различным воздействиям , в молоке погибает через 15-20 минут при температуре 60 гр.С, при аналогичной температуре в мокроте сохраняется до часа, при кипячении погибает через 5 минут. Прямой солнечный свет убивает палочку Коха через 45-55 минут, рассеянный - через 8-10 суток. Хорошо сохраняется при высушивании (до нескольких недель). Обычные химические дезинфектанты относительно мало эффективны, 5% раствор фенола убивает Mycobacterium Tuberculosis лишь через 5-6 часов, возбудитель также способен быстро вырабатывать устойчивость к многим антибактериальным средствам.

5. Патогенез поражений и клинические проявления.

а) Наиболее часто заражение происходит посредством ингаляции аэрозоля, содержащего микобактерии, либо при употреблении контаминированных продуктов (возможно проникновение через кожу и слизистые). Ингалированные микобактерии фагоцитируют альвеолярные и легочные макрофаги и транспортируют их в регионарные лимфатические узлы, фагоцитарные реакции носят незавершенный характер и возбудитель переживает в цитоплазме макрофагов. Способность снижать активность фагоцитов обуславливают сульфатиды, усиливающие токсическое действие корд – фактора, и ингибирующие фагосомо-лизосомальное слияние. Воспалительный ответ обычно не выражен, что в значительной степени опосредовано способностью корд-фактора, тормозить миграцию полиморфно-ядерных фагоцитов. На месте проникновения может развиться первичный аффект. В динамике по ходу регионарных лимфатических путей и узлов формируется первичный комплекс, характеризующийся развитием гранулем в виде бугорков (отсюда бугорчатка, или туберкулез).

• образование гранулем не имеет характерных особенностей и представляет собой клеточную реакцию ГЗТ. Сенсибилизация организма обусловлена действием ряда продуктов микобактерий, известных как старый туберкулин Коха, проявляющий местный и системный эффект. В определенной степени образованию гранулем способствуют образование молочной кислоты, низкое значение рН, высокая концентрация СО2. В центре каждого бугорка расположен участок творожистого некроза, где располагается палочка Коха. Участок некроза окружен эпителиоидными и гигантскими клетками Пирогова-Лангханса. Центр окружают эпителиоидные клетки, а по периметру-лимфоциты, плазмоциты и мононуклеары, наиболее часто первичный очаг наблюдают в легких (очаг Гона). В гранулемах размножение возбудителя обычно замедляется или прекращается совсем.

• Довольно характерен «период латентного микробизма» - состояние, при котором проникшие микобактерии не вызывают развития воспалительных реакций и свободно диссеминируют по организму.

В большинстве случаев первичные очаги заживают с полной

деградацией содержимого, его кальцификацией и фиброзом

паренхимы.

• Клинические проявления обычно отсутствуют либо напоминают гриппоподобный синдром, иногда первичный очаг или увеличенные бронхолегочные лимфоузлы можно выявить рентгенологически.

• Для первичного туберкулеза характерна высокая чувствительность тканей к метаболитам микобактерий, что способствует их сенсибилизации, при заживлении аффекта повышенная чувствительность исчезает и нарастает выраженность иммунных реакций. Однако в этих условиях возможно диссеминирование возбудителя из первичных очагов и формирование очагов-отсевов , обычно они локализованы в легких, почках, половых органах и костях.

б) При ослаблении иммунитета организма очаги активизируются и прогресссируют с развитием вторичного процесса. Определенный вклад в патогенез вносит сенсибилизация организма, вызывающая разнообразные токсико-аллергические реакции у пациента.

• реактивация происходит через 20-25 лет после первичного инфицирования. Обычно ее провоцируют стрессы, нарушения питания и общее ослабление организма. В легких, бронхах и мелких сосудах образуются полости, из которых активно отхаркиваются некротические творожные массы, содержащие значительные количества возбудителя.

• Клинически реактивный туберкулез проявляется кашлем, частое кровохарканьем, снижением массы тела, обильным ночным потоотделением, хроническим субфебрилитетом .

в) В более редких случаях, у ослабленных подростков и взрослых, а также у пациентов с иммунодефицитами, наблюдается диссеминированный ( милиарный) туберкулез, характеризующийся образованием гранулем в различных органах.

• развитие генерализованных поражений часто происходит после прорыва содержимого гранулемы в кровоток.

• Общие проявления аналогичны таковым при вторичном туберкулезе, но к ним часто присоединяются поражения мозга и его оболочек, прогноз такой формы наиболее неблагоприятный.

• Многообразие форм обусловило сложность его классификации.

В настоящее время клиническая классификация выделяет три основные формы:

1. Туберкулезная интоксикация у детей и подростков.

2. Туберкулез органов дыхания, включая первичный комплекс, поражение внутренних лимфатических узлов, плевры, верхних дыхательных путей, очаговый, инфильтративный, кавернозный, фиброзно-кавернозный, цирротический туберкулез легких, туберкулему и др.

3. Туберкулез других органов и систем, включая поражения мозговых оболочек, глаз, суставов и костей, кишечника и брюшины, кожи и подкожной клетчатки. Органов моче-половой системы и т.д.

6. Лабораторная диагностика.

Включает методы, входящие в обязательный диагностический минимум и дополнительные методы исследования.

А). В случае заболевания – микроскопия патологического материала ( мокрота, отделяемое свищей, моча, промывные воды из бронхов) в мазках, окрашенных по Цилю- Нильсену, можно выявить красные кислотоустойчивые палочки.( В проследние годы внедрен метод Мурахаси- Йошиды, позволяющий дифференцировать мертвые и живые бактерии).

• при незначительном содержании возбудителя используется метод накопления по Уленгуту – материал смешивают с равным или двойным объемом NaCl и NaOH, встряхивают и инкубируют 30 минут при температуре 21 гр.С. Затем клетолчный детрит и посторонние бактерии удаляют центрифугированием, осадок нейтрализуют 30% растворм уксусной кислоты и готовят мазки, окрашиваемые по Цтлю-Нельсену или Киньону.

• более эффективен метод флотации- в материал вносят раствор NaOH, дистиллят, ксилол ( бензол) и энергично встряхивают, образующаяся пена всплывает и захватывает микобактерии, ее отсасывают и готовят мазки.

• Определенную ценность в оценке тяжести процесса, эффективности лечения и прогноза заболевания имеет количественная оценка популяции микобактерий методом Гаффки-Стинкена (подсчет бактерий на калиброванных стеклах в определенных полях зрения).

• Наиболее результативный бактериоскопичесий метод – люминесцентная микроскопия, т.к. окраска флюорохромом ( например, аурамин-родамином) позволяет выявлять даже незначительное количество микобактерий ( окрашиваются в бело-желтый цвет), а также формы с изменеными культуральными и тинкториальными свойствами.

Б) Выделение возбудителя. Перед посевом иссследуемый материал можно обработать по Уленгуту или Сумиоши ( 15-20% раствором HCl или H2SO4), исследуемые образцы центрифугируют, отмывают физиологическим раствором и засевают, тщательно втирая на твердые питательные ссреды( обычно Левинштайна-Йенсена). для простоты можно обработать образцы различными антибиотиками, подавляющими рост контаминирующей флоры.

- Недостаток метода- длительность получения результата – от 2 до 12 недель.

- Достоинство- возможность получения чистой культуры, что позволяет ее идентифицировать, оценить вирулентные свойства, определить чувствительность к лекарственным препаратам.

- Разработаны ускоренные методы выделения возбудителя (Прайса), материал помещают на предметное стекло, обрабатывают H2SO4, отмывают физиологическим раствором и вносят в питательную среду, дополненную цитратной кровью. Стекло вынимают через 3-4 суток и окрашивают по Цилю-Нельсену.

- «Золотой стандарт» -в диагностикетуберкулеза – биологическая проба на морских свинках, зараженных подкожно или внутрибрюшинно 1мл материала, полученного от больного. У животных развивается генерализованная инфекция, приводящая к смерти через1-2 месяца, однако заболевание можно распознать раньше постановкой проб с туберкулином –через 3-4 недели, а лимфадениты уже на 5-10 сутки. Пунктаты их содержат большое количество бактерий. Однако, появление резистентных и измененных микобактерий снизило чувствительность данной пробы. Для ее повышения применяют интратестикулярное заражение, либо подавляют иммунитет организма животных введением глюкокортикоидов.

Г. Серологические исследования. Предложено большое количество различных реакций, выявляющих антиген микобактерий и антител к ним, например, РСК, РА. РПГА по Бойдену. ИФА.

Д. Кожные пробы с туберкулином имеют особую значимость, так как позволяют проводить широкомасштабные скрининговые обследования населения. Метод включает внесение небольших доз ( обычно 5 ЕД)

ППД-Л в кожные насечки ( реакция Пирке), подкожно ( реакция Коха).

При положительном результате через 48 часов ( у пожилых –через 72 часа) в месте введения формируется папула диаметром 10мм с гиперемированными краями. В большинстве стран наиболее распространена проба Манту, т.к. результаты реакции Пирке часто вызывают затруднения при их интерпретации.

Положительная реакция Манту указывает на контакт лица с антигеном Mycobacterium Tuberculosis или других бактерий, дающих перекрестную реакцию. Положительную реакцию нельзя рассматривать как признак активного процессса.

При папуле 5-10 мм результат- сомнительный и пробу необходимо повторить с введением10 ЕД.

При меньших размерах – отрицательный результат. (Не всегда указывает на отсутствие процесса- у иммунодефицитных лиц).

Е. ПЦР – диагностика.

Ж.Дополнительные лабораторные методы – оценка иммунного статуса.

Бактериоскопия

(грамположительныеэпалочки

Мокрота, моча, гной, пунктат и т.д.

Бактериоскопия

Бактериоскопия

Биопроба

Сыворотка