Выделение чистых культур бактерий.Docx

Выделение чистых культур бактерий. Выделение отдельных видов микроорганизмов и получение чистой культуры является основой всей бактериологической работы. Чистой культурой микроорганизма называют популяцию, состоящую из особей одного вида. При выделении чистых культур из исследуемого материала, содержащего смесь микробов, используют методы, подразделяющиеся на две основные группы: 1. Методы, основанные на принципе механического разделения микробов. 2. Методы, основанные на биологических особенностях самих микроорганизмов. Методы механического разделения микроорганизмов (методы разбавления). 1) Метод Пастера. Из исследуемого посевного материала делается ряд последовательных разведений в жидкой питательной среде: капля посевного материала вносится в колбу или пробирку со стерильным МПБ, из нее каплю переносят в следующую пробирку и так до 8-10 колб или пробирок, которые термостатируют при оптимальной температуре. С каждым разведением количество микробных клеток, попадающих в среду, будет уменьшаться. В жидких средах микроорганизмы растут диффузно, т.е. легко распространяются по всей толще среды, что не всегда обеспечивает получение чистой культуры. В настоящее время этот метод не применяется, а используется только для предварительного уменьшения концентрации микроорганизмов в материале перед его посевом на плотную питательную среду. 2) Метод Коха. 3-4 пробирки с МПЖ расплавляют в водяной бане при 40-45°С. Исследуемый материал вносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой в пробирку с расплавленным МПЖ, равномерно размешивают его, вращая пробирку между ладонями, каплю разведенного материала из первой пробирки переносят во вторую, из второй в третью и т.д. Содержимое каждой пробирки выливают в стерильные чашки Петри. МПЖ должен равномерно покрыть дно чашки. После того как желатин застынет, чашки ставят, чашки ставят крышкой вверх в термостат при температуре 20-22°С. Вместо МПЖ в настоящее время используют МПА. Каждая попавшая в желатин или агар микробная клетка размножается только в том месте, куда была внесена вначале, и образует видимое невооруженным глазом скопление микроорганизмов - колонию, которую отсеивают на МПБ или скошенный МПА для получения чистой культуры. 3) Метод Дригальского (метод фракционного посева). Этот метод основан на механическом разобщении микробных клеток друг от друга на поверхности плотной питательной среды. Каждая микробная клетка, фиксируясь в том месте, куда она попала, начнет размножаться и через 1-2 дня образует колонию. Используют несколько чашек Петри (чаще 3) с залитой в них плотной питательной средой (МПА). На поверхность застывшей среды в первую чашку вносят каплю исследуемого материала, содержащего микроорганизмы. Затем с помощью стеклянного шпателя ‑­ бактериологической петли каплю растирают по всей поверхности агара после чего этим же шпателем (не обжигая его) проводят по поверхности среды во второй и в третьей чашках. В процессе растирания микробные клетки разъединяются друг от друга. После посева на крышках чашек делают надпись: наименование исследуемого материала или номер анализа посева и номер чашки, фамилия студента Из изолированных колоний выделяют чистую культуру. 4) Метод фильтрации. Основан на пропускании исследуемого материал через специальные мелкопористые фильтры с определенным диаметром пор и разделении содержащихся микроорганизмов по величине. Этот метод применяется, главным образом, для очистки вирусов от бактерий. Методы выделения культур, основанные на биологических особенностях микроорганизмов. 1) Метод нагревания исследуемого материала. Применяется для выделения чистых культур споровых форм микробов (гнилостных, масляно-кислых бактерий и др.). Перед посевом исследуемый материал прогревают на водяной бане при температуре 75-85°С в течение 20-30 мин. Вегетативные клетки погибают, а споры микробов остаются живыми и при последующих высевах на плотную питательную среду прорастают, образуя колонии. 2) Метод Шукевича заключается в точкообразном посеве исследуемого материала в конденсационную воду скошенного агара (у основания скоса). При размножении подвижные формы микробов из конденсационной воды распространяются на агар. Для получения чистой культуры производят отсев выросших микробов из верхней части пробирки. Метод используется для выделения очень подвижной палочки Proteus vulgaris. 3) Метод выделения чистых культур с помощью химических веществ используется для изоляции микроорганизмов, устойчивых к определенным химическим веществам. Некоторые химические вещества (красители, кислоты и антибиотики) угнетают одни и не оказывают влияния на рост других микроорганизмов. Так небольшие концентрации пенициллина задерживают рост грамположительных микробов и не влияют на развитие грамотрицательных; 5-10 % растворы кислот (серной, хлористоводородной) и щелочей быстро убивают большинство микроорганизмов, а микобактерии туберкулеза выживают в растворах такой концентрации и после посева на питательные среды дают рост. 4) Метод обогащения применяют для выделения чистых культур различных микроорганизмов (например, сальмонелл). Для этого производят посев исследуемого материала на питательные среды, способствующие росту определенного микроба. Такие среды называются элективными, например среды Кауфмана, Мюлера для выделения сальмонелл из сильно загрязненного материала. В состав этих сред входят химические вещества, подавляющие рост посторонней микрофлоры и не препятствующие росту сальмонелл. Для молочнокислых бактерий средой обогащения является ‑­ обезжиренное молоко, развиваясь в котором они образуют молочную кислоту, подавляющие посторонние микроорганизмы. 5) Биологический метод выделения чистой культуры применяется для изоляции патогенных микроорганизмов из исследуемого материала, загрязненного большим количеством сапрофитных бактерий. Предполагая в исследуемом материале наличие определенного возбудителя, заражают этим материалом (вводят внутримышечно, подкожно или внутрибрюшинно) лабораторное животное, которое наиболее восприимчиво к данному виду патогенного микроба. Для выделения возбудителя сибирский язвы и стафилококки чаще используют белых мышей; лептоспироза - золотистых хомяков; анаэробных инфекции-кроликов. Если в исследуемом материале содержится подозреваемый возбудитель, то лабораторное животное заболевает и погибает. Труп павшего животного вскрывают и, соблюдая требования асептики, производят посевы из внутренних органов на питательные среды, где вырастает чистая культура только патогенного микроба, так как клетки сапрофитных микроорганизмов, находящиеся вместе с ним, отмирают в организме лабораторного животного под влиянием его защитных факторов (антител, фагоцитов). 2. Изучение морфологических и культуральных свойств. 1) Изучение морфологических свойств микроорганизмов. Изолировав чистую культуру микроорганизма, необходимо определить ее видовую принадлежность. Для этого проводят изучение целого ряда свойств выделенных животных (морфологических, культуральных, биохимических). Для идентификации организмов изучают также антигенные свойства. При установлении вида патогенных бактерий обязательно определяют патогенность на лабораторных животных. Совокупность всех свойств, признаков, особенностей микроорганизмов называют биологическими свойствами. Морфологические свойства изучают путем микроскопии окрашенных препаратов, приготовленных из исследуемых молодых культур, выделенных на плотных или жидких питательных средах. Молодыми культурами для большинства мезофильных микробов считают 1-2-суточные, выращенные при температуре 37°С, а выращенные культуры при 20°С исследуют не позже 2 суток. При описании морфологических свойств необходимо отметить состав питательной среды, температуру роста микроба и возраст культуры. При этом отмечается форма микробных клеток наличие, характер их расположения, размер, наличие спор (их расположение), капсул, наличие инволюционных форм, а также тинкториальные свойства т.е. способность микроорганизмов окрашиваться анилиновыми красителями и по методу Грама. При изучении морфологических свойств параллельно определяют и чистоту культуры. Кроме просмотра окрашенных мазков определяют наличие жгутиков путем исследования подвижности микробов в препаратах висячая ‑­ или раздавленная капля, а также путем посева культуры в полужидкий мясопептонный агар (подвижные бактерии вызывают помутнение агара, а неподвижные растут по линии укола). Характеристика препарата: 1. Чистота культуры: чистая 2 Форма микробных клеток: кокки 3. Величина бактерий: мелкие 4. Характер расположения: кокки, стафилококки 5. Тинкториальные свойства (окраска по Граму): положительная 6. Наличие спор: нет 2) Изучение культуральных свойств микроорганизмов. Этот этап представляет собой изучение особенностей их роста на плотных, полужидких и жидких средах при определенных условиях. Характер роста на плотной питательной среде изучают с подробным описан формы, величины, прозрачности, цвета, поверхности, рельефа, консистенции краев и структуры колоний, образованных на МПА, также изучают характер роста по линии укола при посеве в столбик МПЖ. Бактерии каждого вида формируют колонии с определенными признаками, которые учитывают при идентификации. Характеристика колонии на плотной среде (МПЖ): 1. Форма колонии: круглая с фестончатым краем 2. Диаметр колонии: 2-3 мм 3. Цвет колонии: бело-желтый 4. Рельеф: плоско-выпуклый 5. Поверхность колонии: гладкая 6. Характер краев: фестончатые, с небольшими неровностями 7. Структура колонии: гомогенная 8. Консистенция: кашеобразная 9. Блеск: присутствует 10. Прозрачность: полупрозрачная Характеристика в жидкой среде (МПБ): 1. Степень помутнения: слабое 2. Наличие пленки на поверхности: тонкая, нежная 3. Наличие пристеночного кольца: слабо выражено 4. Наличие осадка: хлопьевидный 5. Цвет среды: желтый. 3.Изучение биохимических свойств. У микроорганизмов разных видов в пределах рода есть общие (родовые) и специфические для отдельных видов ферменты. В связи с тем, что каждый вид микробов характеризуется важнейшим этапом идентификации микроорганизмов. ‑­ О наличии того или иного фермента судят по способности микроорганизма воздействовать на известный субстрат. Присутствие фермента выявляют по изменению физического состояния субстрата (разжижению желатина), закислению питательной среды (среды Гисса с углеводами). Образованию определенных продуктов метаболизма (индол, аммиак, сероводород) и т.д. Ферментативная активность микробов чрезвычайно разнообразна. Она зависит от характера и количества ферментов, которые микробная клетка продуцирует и выделяет во внешнюю среду. При изучении ферментативной активности микробов наибольшее значение придают определению сахаролитических, протеолитических, липолитических и окислительно-восстановительных ферментов, активирующих соответственно расщепление углеводов, белков липидов и редуцирующих некоторые органические красители. Выявление сахаролитической активности. Сахаролитическую активность изучают по образованию микроорганизмами экзоферментов карбогидраз (глюкозидаз), по интенсивности образования органических кислот и ароматических веществ. Сахаролитическая способность микробов определяется по ферментативному расщеплению моносахаридов, полисахаридов, многоатомных условно именуемых «сахарами» на альдегиды, органические кислоты и газообразные продукты (углекислый газ, метан, водород). Конечными продуктами их расщепления являются углекислый газ и вода. Для определения способности микроорганизмов расщеплять сахара используют специальные дифференциально-диагностические среды жидкие, полужидкие и плотные питательные среды. При отсутствии у микробов какого-либо фермента углеводы не расщепляются, индикатор остается в обесцвеченной форме, цвет среды не изменяется. Если под действием ферментов микробов углевод сбраживается, о образуется органическая кислота, которая вступает в реакцию с веществами, обесцвечивающими индикатор (со щелочью или розоловой кислотой) и нейтрализует их. В результате этого происходит восстановление цвета индикатора и окрашивание среды в розово-малиновый (с индикатором Андреде) или голубой (с индикатором «ВР») цвет. Для выявления сахаролитических ферментов исследуемую культуру засеивают в среду Гисса, которая содержит 5 моноуглеводов: глюкозу, лактозу, маннит, мальтозу, сахарозу. Сахара и спирты, используемые для сред Гисса, должны быть химически чистыми. Результат: Цвет среды изменился, значит есть фермент, под действием которого расщепляется углевод - рН среды меняется, а индикатор изменяет свой цвет. ‑­

Углевод	Сахаролитическая	активность
	кислота	газ
лактоза	+	-
глюкоза	+	-
манит	+/-	-
сахароза	+/-	-

Изучение протеолитических свойств микробов. Некоторые микроорганизмы продуцируют и выделяют во внешнюю среду протеолитические ферменты - протеазы, которые расщепляют белки до промежуточных продуктов (пептоны, альбумозы, полипептиды, аминокислоты) или до продуктов конечного распада белка (индол, сероводород, аммиак и др.) Для выявления протеолитических ферментов исследуемую культуру засеивают в питательную среду, содержащий тот или иной белок (МПЖ, молоко, свернутую кровяную сыворотку). Протеолитическая активность микробов на желатине определяется по разжижению столбика желатина под действием фермента желатиназы разжижение желатина может быть послойное, воронкообразное, в виде чулка. В молоке микробы, выделяющие протеолитические ферменты, через несколько дней вызывают свертывание и пептонизацию молока. Пептонизация сопровождается отделением молочной сыворотки, растворением сгустка казеина под действием фермента казеиназы и выпадением осадка. Для идентификации видов существенное значение имеет выявление способности микробов гидролизовать белок до продуктов глубокого распада: индола, сероводорода, аммиака. Индол (орто-бензопирил) образуется при расщеплении ферментом триптофаназой сложной гетероциклической аминокислоты триптофана. Источниками образования сероводорода могут быть различные соединения среды: органические (цистеин, цистин, метионин) и неорганические (сульфиты, сульфаты, тиосульфата). Для определения образования сероводорода делают посев в пробирку с МПБ, в которую под пробку над средой помещают кусочек стерильной фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца. Если исследуемая культура при разложении белка выделяет сероводород, то образуется сульфид свинца, в результате чего появляется темно-бурое окрашивание фильтровальной бумажки. Присутствие аммиака определяют по изменению цвета красной лакмусовой бумажки (синеет), а также при помощи реактива Несслера. ‑­ Результат: Сделав посев в МПБ, дополнительно поместив под пробирку кусочек стерильной фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца, наблюдается выделение сероводорода, а вследствие этого наблюдается потемнение бумажки, т.е. сероводород является продуктом жизнедеятельности этих микроорганизмов. 4. Определение видов бактерий Выполнив посев и изучив морфологические, культуральные и биохимические свойства данного вида микроорганизмов, проанализировав их, я сделал вывод, что наиболее подходят под описание кокки рода Staphilococcus, вида Saprophyticus. Характеристика вида Кокки, располагаются группами в форме виноградной грозди, грамположительные, каталазоположительные, факультативные анаэробы, хорошо размножаются на простых питательных средах и быстро размножаются на средах с большой концентрацией NaCI (ЖСА), образуя на плотных питательных средах семества с белым, желтым или золотистым пигментом. Обладают хорошо выраженными протеолитическими свойствами: разжижают желатин, свертывают и пептонизируют молоко, вызывают гемолиз, выделяют аммиак, сероводород.