лекции по микробиологи / КОКЛЮШ

Лекция № 4

План лекции:

1.Бордетеллы

1. Возбудитель коклюша.

1.1.1.Морфологические свойства.

2. Культуральные и антигенные свойства.

3. Патогенность для человека и локализация в организме.

4. Лабораторная диагностика.

2.Коринебактерии

2.1.Возбудитель дифтерии. Морфологические, культуральные, биохимические и антигенные свойства.

2. Биовары. Дифференциация возбудителя дифтерии и условно-патогенных коринебактерий.

3. Факторы патогенности, дифтерийный токсин, генетический контроль его образования.

4. Патогенез дифтерии. Бактерионосительство.

5. Лабораторная диагностика

В род Воrdetella включены Bord. Pertussis, Bord. Parapertussis, Bord. Bronchoseptica.

Вordetella pertussis выделена от больных коклюшем в 1906 году Ж Борде и О Жангу.

Морфология Возбудитель коклюша представляет собой мелкие неподвижные коккобактерии, они слабо окрашиваются обычными анилиновыми красками, причем концы клеток воспринимают краситель более интенсивно, грамотрицательны.

Культивирование Бактерии коклюша не растут на обычных питательных средах, хорошо культивируется при 35-37 град в аэробных условиях на глицериново-картофельном или кровяном агаре с рН 6,8- 7,4, на котором она развивается с образованием мелких и выпуклых блестящих колониях, напоминающих капельки ртути. Колонии бактерий коклюша бывают зернистыми и гладкими. В кровяном бульоне эти бактерии образуют муть и небольшой осадок. В настоящее время широко используется казеиново-угольная агаровая среда, на которой бактерии коклюша хорошо растут без добавления крови. коклюшные бактерии, культивируемые на средах без крови диссоциируют на четыре фазы: две фазы представляют собой вирулентные культуры, а третья и четвертая- не вирулентные.

Колонии 1 и 2-й фазы мелкие с ровными краями, выпуклые (S-форма). При микроскопии мазков обнаруживаются небольшие с закругленными концами овоидные бактерии, которые хорошо агглютинируются до титра гомологичными сыворотками. Колонии 3 и 4-й фазы ( R-формы) крупные, плоские, блестящие; бактерии агглютинируются сыворотками 1 и 2-й фаз, но агглютинируются до титра гомологичными сыворотками.

Ферментативные свойства. Бардетеллы не ферментируют белки, углеводы, мочевину, образуют каталазу.

Токсинообразование. Возбудитель коклюша образует термолабильный экзотоксин, вызывающий у кроликов и морских свинок геморрагический отек, некроз и изъязвление, продуцирует гистаминсенсибилизирующий и стимулирующий лимфоцитоз факторы.

Бактерии коклюша обладают способностью коагулировать плазму крови кролика, барана, теленка и человека.

Антигенная структура. Бактерии рода Bordetella содержат общий термостабильный соматический О антиген и различные специфические агглютиногены. У бордетелл выявлено 14 антигенных комнонентов ( факторов). Фактор 7 является родовым, общим для всех бордетелл; фактор 1 свойственен Bord. pertussis, фактор 14- Bord, parapertussis, фактор 12 - у Bord. Bronchoseptica. чаще других у Bord. pertussis встречаются типы 1,2;1,3 и 1,2,3. У Bord. parapertussis - 8,9,10,a У Bord. Bronchoseptica- 8,9,10,11,13.

Перекрестного иммунитета между палочкой коклюша, паракоклюша и бронхосептика не наблюдается.

Патогенез заболевания у человека. Возбудитель передается от больного к здоровому воздушно-капельным путем. Наиболее заразны больные в катаральный период. Роль различных предметов, окружающих больного, в связи с неустойчивостью возбудителя к воздействию факторов внешней среды ничтожна. Источника инфекции могут быть больные с атипичными формами болезни. Коклюш является болезнью детей младшего возраста. Инкубационный период длится 9 суток. Болезнь характеризуется типичными симптомами и цикличным течением. Различают три периода типичного коклюша: 1) катаральный период продолжается около 2 недель; 2) конвульсивный период ( судорожного кашля) сопровождается приступами кашля при нормальной температуре тела и продолжается 4-6 недель; 3) период угасания ( разрешения) длится 2-3 недели.

Бактерии размножаются в слизистой оболочке верхних дыхательных путей; в кровь они не проникают. Экзотоксины, выделяемые палочкой коклюша, вызывают катаральное воспаление слизистой оболочки трахеи и бронхов; раздражают рецепторы слизистой оболочки и обуславливают непрерывный поток импульсов в центральную неврную систему, образуя стойкий очаг возбуждения. Приступы кашля развиваются под влиянием как специфических ( экзотоксин), так и неспецифических ( звук, инъекции, осмотры) раздражителей. При возникновении более сильных центров возбуждения доминантный очаг возбуждения угасает, приступы прекращаются.

Лабораторная диагностика. Объектами исследования являются мокрота больных или отделяемое слизистой оболочки носоглотки. Материал берут специальным тампоном. Мокроту сеют на среду Борде-Жангу, молочно-кровяной агар, гидрализатно-казеиновую среду, казеиново-угольную среду и др. Для подавления роста посторонней микрофлоры добавляют антибиотики (пенициллин) Хороший результат дает метод “кашлевые пластинки”. Через 2-5 суток роста на среде Борде=Жангу появляются т+ипичные мелкие колонии, выпуклые, блестящие, похожие на перламутр или капли ртути. Выделенную чистую культуру идентифицируют по морфологическим, культуральным, биохимическим и антигенным свойствам. Со второй недели болезни ставят реакцию агглютинации с помощью которой выявляют не только типичные, но и атипичные формы заболевания.

Коринебактерии К группе Coryneform, роду Сorynebacterium относят бактерии, имеющие булавовидные утолщения на концах: коринебактерии, патогенные для человека и животных, коринебактерии для растений непатогенные коринебактерии (дифтероиды).

коринебактерии дифтерии (Corynebacterium diphtheriae). Нетоксигенные коринебактерии дифтерии не вызывают дифтерийную инфекцию. “Этиологическая” значимость этих микроорганизмов при неинфекционной Возбудителем дифтерийной инфекции являются Токсигенные патологии ( фарингит, артрит, эндокардит и т.д.) требует специального доказательства.

Таксономически близкими виду коринебактерий дифтерии являются C. ulcerans и C. pseudotuberculosis ( C. ovis). Данные микроорганизмы природные патогены крупного и мелкого рогатого скота, лошадей. Отмечена способность этих видов бактерий вырабатывать токсин, подобный дифтерийному. Встречаются и “нетоксигенные” штаммы. Известны случаи выделения “токсигенных” C. ulcerans при клинической картине заболевания, сходного с дифтерией.

На слизистой оболочке ротоглотки и носа в норме часто встречается ложнодифтерийная палочка Гофмана ( C pseudodiphthericum).

Леффлер Ф. (1884) выделил возбудитель в чистой культуре, Э. Ру и Иерсен А. (1888) получили токсин, Э Ру (1894) Беринг и Китозато (1890) получили -антитоксическую сыворотку, Р. Рамон (1923) получил дифтерийный анатоксин.

Морфология Дифтерийные коринебактерии - прямые или слегка изогнутые палочки, им характерен значительный полиморфизм- разнообразие размеров и формы клеток. Клетки имеют форму булавы, ракетки, овоида. Взаиморасположение клеток напоминает римские цифры Х,V. При окраске часто обнаруживается выраженная внутриклеточная исчерченность, что объясняется наличием зерен волютина. Описано сродство волютина к метиленовому синему и, при обработке этим красителем, гранулы или полоски ( скопления гранул) прокрашиваются в синий цвет, а протоплазма в отдельных случаях может приобретать розовый оттенок. Использование в бактериологической практике окраски по Граму является нецелесообразным, поскольку клетки C. Diphtheriae легко обесцвечиваются спиртом и могут выглядеть в мазках грамвариабельными или даже грамотрицательными. Для C. ulcerans b C. pseudodiphthericum характерна склонность к параллельному расположению клеток. 24-48 часовые культуры этих видов имеют чаще всего овоидную форму клеток. У дифтерийных коринебактерий наблюдаются булавовидные утолщения по концам; иногда появляются ветвистые и нитевидные формы, а также короткие образования, почти кокковидные и дрожжеподобные. В мазках они располагаются под углом, принимая вид растопыренных пальцев, не образуют спор, капсул и жгутиков, грамположительны.

Культивирование. Возбудитель дифтерии - аэроб или факультативный анаэроб, оптимальная температура роста 37 град. Хорошо культивируется на средах, содержащих белок ( свернутая сыворотка), кровяной агар, сывороточный агар), а также на сахарном бульоне. Для первичного посева исследуемого материала используются следующие питательные среды: среда Клауберга 11( к питательной основе добавляется глицериновая смесь, “лаковая кровь” и теллурит калия), Кровяной теллуритовый агар (КТА), сывороточный агар (для отсева колоний), мартеновский агар с мясной водой двойной концентрации сухая хинозольная дифференциально-диагностическая среда Бучина. Дифтерийные коринебактерии развиваются в течение 16=18 часов; рост их напоминает шагреневую кожу; колонии между собой не сливаются.

По культуральным и биологическим свойствам коринебактерии дифтерии подразделяются на три биовара:gravis, mitis и intermedius, которые отличаются друг от друга по ряду признаков. Коринебактерии биовара гравис, как и колонии C.ulcerans на теллуритовом агаре, содержащем дефибринированную кровь и теллурит калия, через 48 часов образуют крупные шероховатые R-формы розеткообразные колонии черного или серого цвета имеют радиальную исчерченность.

Коринебактерии дифтерии вариант гравис ферментируют декстрин, крахмал и гликоген, в бульоне образуют поверхностную пленку и зернистый осадок, обычно высокотоксичны и обладают более выраженными инвазионными свойствами.

Коринебактерии биовара митис на теллуритовом агаре растут с образованием темных гладких S форма блестящих колоний. Они ферментируют крахмал и гликоген, декстрин ферментируют не постоянно, вызывают гемолиз эритроцитов всех видов животных, в бульоне отмечается диффузное помутнение. Культура этого типа, как правило менее токсигенны и инвазионны, чем коринебактерии биовара гравис.

Коринебактерии биовара интермедиус занимают промежуточное положение. Колонии у них на теллуритовом агаре мелкие ( R-,S-формы), черного цвета, не ферментирует крахмал и гликоген, в бульоне растут с появлением мути и зернистого осадка. Колонии C. pseudodiphthericum имеют характерный светлый ободок.

Ферментативные свойства Дифтерийные коринебактерии ( все три биовара) не свертывают молоко, не разлагают мочевину, не выделяют индол, слабо образуют сероводород, восстанавливают нитраты в нитриты, а также теллурит калия в сульфат теллурита, вследствие чего колонии дифтерийных коринебактерий на теллуритовом агаре становятся четными или серыми. Дифтерийные коринебактерии ферментируют глюкозу и мальтозу, непостоянно - галактозу, крахмал, декстрин, глицерин.

Токсинообразование. Дифтерийные коринебактерии продуцируют в бульонных культурах сильные экзотоксины ( гистотоксин, дермонекротоксин, гемолизин). Токсигенность коринебактерий дифтерии связана с лизогенностью ( наличие в токсигенных штаммах умеренных фагов - профагов). Классический международный эталонный штамм Парк-Вильямс 8- продуцент экзотоксина- также является лизогенным и более 85 лет сохраняет способность к токсинообразованию. Генетические детерминанты токсигенности ( tox+ -гены) локализованы в геноме профага, интегрированного с нуклеидом коринебактерии дифтерии. Конверсия нетоксигенных штаммов коринебактерии дифтерии в токсигенные и наоборот воспроизводится только в особых, экспериментальных условиях. В тех случаях, когда при первичном посеве испытуемого материала от больных дифтерией выделяют токсигенные штаммы, а при повторном обследовании после лечения антибиотиками- нетоксигенные коринебактерии дифтерии, можно предположить, что при использовании антибиотиков в первую очередь исчезают токсигенные штаммы, как более чувствительные к их действию, а нетоксигенные штаммы продолжают выделяться. Такое же положение может наблюдаться при санации антибиотиками бактерионосителей, одновременно выделяющих токсигенные и нетоксигенные коринебактерии дифтерии. Обнаружение у таких носителей при повторных обследованиях только нетоксигенных штаммов нельзя трактовать как утрату способности штаммов продуцировать экзотоксин.

Дифтерийный экзотоксин представляет собой сложный комплекс. Он получен в кристаллическом виде.

Токсигенные штаммы дифтерийных коринебактерий наряду с лизогенностью характеризуются выраженной дегидрогиназной и нейраминидазной активностью.

Дифтерийный токсин неустойчив. Он легко разрушается под влиянием температуры, света и кислорода воздуха. Сравнительно резистентен к действию ультразвука. После добавление к токсину 0,3- 0,4 % формалина и последующее выдерживание при 38-40 град в течение 3-4 недель происходит превращение его в анатоксин, который обладает большей устойчивостью по отношению к физическим и химическим воздействиям, чем исходный токсин.

Под влиянием умеренного фага ( конвертирующий фаг) коринебактерии биовара гравис в ряде случаев происходит фаговая конверсия непатогенных коринебактерий биовара митис в Токсигенные. Дифтерийные коринебактерии продуцируют бактериоцины ( коринецины), наделяющие их некоторыми селективными преимуществами.

Антигенная структура. Путем реакции агглютинации у возбудителя дифтерии установлено 11 сероваров.

Токсины, образуются различными штаммами биовара гравис и митис, не различаются между собой и полностью нейтрализуются стандартным дифтерийным антитоксином. Рядом авторов установлено наличие у коринебактерий дифтерии вариантоспецифических термолабильных поверхностных белковых антигенов ( К-антигенов) и группоспецифических термостабильных соматических полисахаридных антигенов.

Среди коринебактерий дифтерии имеется 19 фаготипов, с помощью которых выявляются источники инфекции; фаготипы учитываются также при идентификации выделенных культур.

Патогенез заболевания у человека. Источником инфекции являются больные и носители. Заразное начало передается воздушно-капельным путем, иногда с частицами пыли; передача возможна также через различные предметы( игрушки, посуда, полотенца, и платки и т.д.), пищевые продукты ( молоко, различные холодные блюда и другое), инфицированные дифтерийными коринебактериями.

В эпидемиологии дифтерии большую роль играют носители. В среднем число носителей из реконвалесцентов и здоровых лиц колеблется в пределах 3-5%.

Наибольшая заболеваемость дифтерией отмечается в осенние месяцы года, что объясняется скученностью и снижением сопротивляемости организма под влиянием охлаждения.

В патогенезе дифтерии ведущую роль играет гистотоксин, которых блокирует протиосинтез в клетках млекопитающих, инактивирует Фермент трансферазу, ответственную за образование полипептидной цепи.

Дифтерийные коринебактерии благодаря наличию у них диффузионного фактора обладают способностью протекать в кровь и ткани больных людей и зараженных животных. Диффузионный фактор представляет собой фермент гиалуронидазу, обладающую способностью расщеплять гиалуроновую кислоту. К факторам инвазионности относятся нейраминидаза, некротический фактор, фибринолизин.

В клинике и эксперименте на животных доказано влияние на развитие болезни патогенных стафилококков и стрептококков, которые в значительной степени усиливают тяжесть инфекции.

У человека на месте внедрения возбудителя дифтерии ( зев нос, трахея, коньюнктива глаза, кожа, вульва влагалища, раневая поверхность) образуются пленки с большим количеством дифтерийных коринебактерий и других микробов. Продуцируемый экзотоксин вызывает некроз и воспаление слизистых оболочек или кожи; всасываясь он поражает нервные клетки, сердечную мышцу и паренхиматозные органы, обусловливает явление общей, тяжелой интоксикации. Глубокие изменения происходят в сердечной мышце, сосудах, надпочечнике, а также в центральной и периферической нервной системы.

По локализации процесса наиболее часто наблюдается дифтерия зева и дифтерийный круп, затем дифтерия носа. Сравнительно редко встречается дифтерия глаз, ушей, половых органов, кожи. На дифтерию зева приходится более 90% всех заболеваний, второе место занимает дифтерия носа.

Лабораторная диагностика. Объектом для исследования служит отделяемое зева, носа, иногда вульвы, глаз, кожи, которые берут стерильным ватным тампоном.

Материал, подлежащий исследованию, высевают на специальные среды- свернутую сыворотку, среду Клауберга 11, кровяной теллуритовый агар, сывороточно-теллуритовый агар и другие. Через 12-24-48 часов культивирования производится микроскопия мазков. По результатам микроскопии дают предварительный ответ,

В бактериологической практике опираться только на морфологические свойства колоний или микробной клетки при идентификации C. diphtheriae, не представляется возможным. Описаны случаи бактериологической гипо- и гипердиагностики ( в 55% и 14,5% случаев соответственно). Когда используется только учет морфологических признаков. При идентификации коринебактерий дифтерии необходимо использовать комплекс тестов, в первую очередь, определение патогенности (токсигенности), основного признака возбудителя дифтерии.

Определение токсигенных свойств производится бактериологами в первые сутки роста подозрительных колоний на чашках первичного посева материала. Во избежание ошибок при определении токсигенных свойств коринебактерий, необходимо изучать данный признак у максимального числа выросших колоний с чашек первичного посева.

Ферментативная активность микроорганизмов изучается путем определения ферментов цистиназы, уреазы, способности расщеплять до кислоты глюкозу, сахарозу, крахмал. В редких случаях, когда необходимо идентифицировать C. ulcerans, добавляется тест на восстановление нитратов в нитриты.

Таким образом, выделенный микроорганизм является возбудителем дифтерии, если он обладает токсигенными свойствами, определенным спектром ферментативной активности ( расщепление глюкозы, крахмала, отсутствие разложения сахарозы, наличие фермента цистиназы, отсутствие фермента уреазы) и характерными морфолого-культуральными признаками ( образование колоний черного или серого цвета на кровяно-теллуритовых средах, с учетом, при необходимости, морфологии клеток - полиморфные, не образующие спор палочки).

В настоящее время для выявления слаботоксигенных штаммов C. diphtheriae, определения уровня токсинообразования циркулирующих штаммов и, в некоторых случаях, для сокращения сроков идентификации дифтерийного токсина и выдачи предварительного ответа может использоваться реакция непрямой гемагглютинации для выявления дифтерийного токсина.

РНГА-двухкомпонентная реакция, предполагающая использование диагностикума эритроцитарного дифтерийного антительного, действующим началом которого являются связанные с эритроцитами очищенные специфической сорбцией поликлональные антитоксические противодифтерийные антитела *антитоксин), вступающий во взаимодействие лишь с дифтерийным токсином ( анатоксином). При наличии в исследуемой пробе токсина образуется специфический комплекс: дифтерийный токсин+сенсибилизированные антитоксином эритроциты. В результате формируется осадок в виде агглютината эритроцитов.

Для изучения напряженности противодифтерийного иммунитета проводят определение уровня антитоксических противодифтерийных антител в сыворотке крови человека в ВПГА.

Реакция пассивной гемагглютинации ( РПГА) - двухкомпонентная реакция, предполагающая взаимодействие диагностикума эритроцитарного дифтерийного антигенного, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них дифтерийным анатоксином, и антитоксических противодифтерийных антител, находящихся в сыворотке крови обследуемых. При наличии в исследуемой сыворотке антитоксина образуется специфический комплекс: антитоксин+ сенсибилизированные анатоксином эритроциты. В результате формируется осадок в виде агглютината эритроцитов.

Список литературы:

1. Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С.- Микробиология, М. 1981

2. Тимаков В.Д. ,Левашев В.С. Борисов Д.В.- Микробиология, М, 1983

3. Джавец Э., Мельник Дж. Л., Эйдельберг Э.А.- Руководство по медицинской микробиологии, М., 1982.

4. Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции./ МУ 4.2.698-98, М. 1998