Новиков Д.К. Медицинская микробиология

го течения приводил к летальному исходу. В 2003 г. было доказано, что возбудителем болезни является новый, ранее неизвестный вариант коронавируса.

Структура и свойства. Это крупные (до 220 нм) вирусы, имеющие липопротеиновый суперкапсид сферической или овальной формы. Тип симметрии спиральный, диаметр нуклеокапсида 25 нм. Между нуклеокапсидом и наружной липопротеиновой оболочкой находится промежуточный белковый слой (матрикс). Снаружи вирион имеет наружные гликопротеиновые шипы, которые в электронном микроскопе напоминают солнечную корону вокруг округлого центра вирусной частицы.

Геном представлен позитивной молекулой РНК, обладающей инфекциозностью. РНК генома состоит из 30 тыс. пар оснований – это максимальный из известных вирусных геномов, содержащих РНК. Репликация вирусов происходит медленно в цитоплазме пораженных клеток.

В состав коронавирусов входят нуклеокапсидные, матриксные и суперкапсидные белки, обладающие антигенными свойствами. Вирусы человека и животных имеют как общие, так и специфические антигенные детерминанты. Наружные шипы суперкапсида состоят из гликопротеинов, они обеспечивают адсорбцию и проникновение коронавирусов в клетки. Выход вирионов из клетки осуществляется почкованием. Вирусы проявляют гемагглютинирующую активность.

Коронавирусы чувствительны к эфиру и детергентам, ультрафиолетовому облучению, температуре свыше 560С, большинству дезинфектантов.

Культивирование. Данные вирусы плохо растут в клеточных культурах. Некоторые варианты адаптированы к культурам клеток почек зеленых мартышек, клеткам Vero, органным культурам, лабораторным животным (мышам-сосункам).

Характеристика коронавирусных инфекций.

Основной путь передачи заболеваний – воздушно-капельный. Известные до 2002 г. коронавирусы вызывают ОРВИ, которые у

взрослых обычно протекают бессимптомно или проявляются ринитом с обильными серозными выделениями. Коронавирусные гастроэнтериты приводят к диарее, в желудочно-кишечный тракт вирус попадает вторично вследствие вирусемии. Поражение обусловлено цитопатическим действием вируса на зараженные клетки.

Иммунитет при заболеваниях гуморальный, типоспецифический. Образуются вируснейтрализующие АТ, которые обеспечивают невосприимчивость к повторному заражению данным сероваром. Обычно инфекция длится не более 1 недели.

Лабораторная диагностика. Так как вирус плохо культивируется

321

на культурах клеток, то вирусологический метод используют редко. В качестве экспресс-метода применяют РИФ, материалом для которого является отделяемое носоглотки или мазки-отпечатки слизистой носа. Основной метод диагностики – серологический, при этом в сыворотке больного обнаруживают АТ к вирусу в РСК, РПГА, РТГА, ИФА в реакции с парными сыворотками. Используют метод парных сывороток.

Специфическая профилактика не проводится, лечение симптоматическое.

20.1.3.2. Возбудитель тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС-ассоциированный коронавирус)

В конце 2002 г. в южной китайской провинции Гуаньдун появились первые случаи необычно тяжелой «атипичной» вирусной пневмонии. Количество заболевших быстро достигло нескольких сотен, заболевание распространилось в Гонконг, вышло за пределы КНР в Сингапур, Вьетнам, другие страны Юго-Восточной Азии. Далее в эпидемию были вовлечены страны Северной Америки (Канада, США), Европы (Германия, Италия) и другие. Болезнь получила название тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС,

англ. аббревиатура SARS – severe acute respiratory syndrome). Учиты-

вая темпы развития эпидемии, высокую для респираторных вирусных инфекций летальность (до 5-10% от общего числа заболевших) Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) впервые в своей истории объявила глобальную угрозу по данному заболеванию. К маю 2003 г. от заболевания пострадало свыше 4500 человек, более 250 из них умерли. ТОРС-инфекция считается первой значительной эпидемией, возникшей в XXI веке.

Через несколько месяцев от начала эпидемии удалось установить природу инфекционного агента, вызывающего ТОРС. Им оказался новый, ранее неизвестный представитель семейства Coronaviridae. Он получил название «ТОРС-ассоциированный коронавирус» (ТОРСвирус).

Структура и свойства. В апреле 2003 г. был полностью расшифрован геном нескольких вариантов ТОРС-вируса, выделенных от больных атипичной пневмонией. На основе анализа вирусного генома, данных электронной микроскопии, культивирования вируса в клеточных культурах были изучены основные свойства ТОРСассоциированного коронавируса.

Внешне вирус сходен с другими представителями семейства. Геном вируса представлен однонитевой (+)РНК размером 29,7

тыс. пар нуклеотидов, содержащей 41% остатков Г+Ц. Общая организация генома совпадает с уже известными коронавирусами.

Однако анализ последовательности РНК показал, что вирус

322

должен быть выделен в новую отдельную 4 группу коронавирусов. Наиболее вероятно его происхождение от одного из малоизвестных коронавирусов животных, или от непатогенного коронавируса человека вследствие мутаций.

Геном вируса содержит гены, которые кодируют одноименные антигены – структурные белки и ферменты. Ген rep определяет синтез ферментов репликации РНК (полимеразы, хеликазы, протеазы), S – белка, входящего в состав шипов, E и М – белков оболочки, N – нуклеокапсида. Дополнительно у вируса различают не менее 5 неструктурных белков, которые участвуют в его репликации.

Вирус поступает в клетки эпителия верхних дыхательных путей в результате взаимодействия S-белка с рецепторами клеток. S-белок представляет собой гликопротеин, ответственный за адсорбцию и слияние вирусной частицы с пораженными клетками.

После депротеинизации происходит репликация РНК вируса. Предполагается, что она осуществляется через синтез промежу-

точной (–) цепи РНК, которая является матрицей для синтеза инфор-

мационной (+) цепи РНК (прерывистая транскрипция).

После сборки вирусных частиц происходит выход вируса из клетки путем почкования с участием белков M, E, N.

Клетки эпителия верхних дыхательных путей могут поражаться как из-за ЦПД вируса, так и вследствие развития иммунной реакции на вирусные белки в мембране клеток.

Устойчивость вирионов. В сравнении с другими коронавирусами ТОРС-вирус является относительно устойчивым. При комнатной температуре он сохраняется в фекалиях и моче в течение 2-4 дней. Сохраняется при низких температурах не менее 3 недель. Прогревание при 560С полностью инактивирует вирус за 15 минут. Вирус чувствителен ко всем основным дезинфектантам

Характеристика заболевания. Источник инфекции – больной человек. Основной механизм передачи – воздушно-капельный. Не исключается передача по фекально-оральному и контактному механизмам. Наиболее велика вероятность инфицирования у лиц, находящихся в близком контакте с больным. К группам риска относится работающий с больными медперсонал, члены семьи заболевших или другие лица, имевшие прямой контакт с выделениями больного.

Инкубационный период – от 1 до 7-10 дней. Заболевание начинается остро, у больного появляется лихорадка, миалгии. Вирус поражает всю дыхательную систему, включая легкие. Изменения в легких выявляются при рентгенографии. Вследствие гематогенной диссеминации вируса в процесс вовлекается желудочно-кишечный тракт, возникает диарея.

Через несколько дней температура может снизиться. Однако на

323

второй неделе у части больных лихорадка появляется вновь, возникают новые очаги поражений в легких, прогрессирует дыхательная недостаточность, усиливается диарея. Так как к этому времени уровень репликации вируса снижается, предполагается, что ухудшение связано с иммунопатологическими процессами, обусловленными вирусом. У 20% больных на 2-3 неделе развивается респираторный дис- тресс-синдром вследствие повреждения гемато-альвеолярного барьера с развитием отека легкого.

По мере развития заболевания у больных появляется выраженный противовирусный иммунитет, преимущественно гуморальный. В культурах клеток антитела, выделенные от больных, проявляют стойкое нейтрализующее действие в отношении вируса.

Прогноз тяжелого острого респираторного синдрома достаточно серьезный, однако при использовании всех современных методов лечения число летальных исходов удается значительно снизить.

Лабораторная диагностика заболевания. Используются следующие основные методы диагностики – полимеразная цепная реакция и серологический метод. Для ПЦР материалом для исследования является носоглоточное отделяемое, фекалии, реже моча. Диагноз ТОРС считается установленным, если по результатам ПЦР соблюдается одно из условий:

1)положительны обе пробы из разных материалов, взятых от пациента;

2)положительны 2 пробы одного материала, полученные от больного с интервалом в 2 дня,

3)повторный ПЦР-анализ материала также положителен.

При серологическом методе исследования материалом является сыворотка больного, содержащая АТ к ТОРС-вирусу. Используется твердофазный ИФА. У здоровых лиц АТ к вирусу не обнаруживаются. У больных реакцию необходимо ставить с парными сыворотками (наблюдается появление противовирусных АТ и увеличение их титра

в4 раза и более).

Внаиболее оснащенных вирусологических лабораториях проводится выделение вируса на клеточных культурах (например, культуре клеток Vero) с подтверждением выделения вируса при помощи ПЦР.

Профилактика и лечение. В настоящее время меры профилактики остаются неспецифическими. С учетом секвенирования генома вируса в ближайшее время возможна разработка вакцины.

Для лечения применяют противовирусный препарат рибавирин, для подавления иммунопатологических реакций используют глюкокортикостероиды.

324

20.1.4. Семейство пикорнавирусов (Picornaviridae)

Вирусы из семейства Picornaviridae (образовано от двух слов: picos – маленький, RNA – содержит РНК) имеют размеры 17-40 нм; кубический тип симметрии; содержат (+)РНК, линейную, однонитчатую, обладающую инфекциозностью; состоят из 60 капсомеров; суперкапсида нет. Вирусы не имеют липидов, устойчивы к эфиру и детергентам.

В семействе имеются роды:

Enterovirus,Parechovirus,Hepatovirus, Rhinovirus, Cardiovirus, Aphtovirus.

20.1.4.1. Энтеровирусы

К роду энтеровирусов относятся: 3 типа (1, 2, 3) вируса полиомиелита, патогенные для человека; вирусы Коксаки А 1-22, 24; Коксаки В 1-6 серотипы; вирус ECHO 1-33 серотипы (кроме 10, 22, 23, 28 типов); пареховирусы – типы 22, 23; энтеровирусы серотипов 68-71.

Вирус полиомиелита (Poliovirus).

Вирус полиомиелита вызывает полиомиелит – одно из древнейших заболеваний человека, о чем свидетельствуют археологические материалы. Полиомиелит – воспаление серого вещества мозга (polies – серый, myelitis – воспаление спинного мозга). Открыт в 1909 г. Ландштейнером и Поппером при заражении обезьян мозговой тканью ребенка, умершего от полиомиелита. Полиовирус представлен тремя серотипами, которые относятся к роду Enterovirus семейства

Picornaviridae.

Морфология и свойства. Вирион представляет икосаэдрическую частицу диаметром 27 нм, капсид состоит из 60 субъединиц, каждая из которых содержит 4 белка (VP1-VP4) и окружает геном, представленный одноцепочной (+)РНК. Капсидные и некапсидные белки вириона формируются путем расщепления крупных полипротеиновпредшественников. Три более крупных белка (VP1-VP3), сходны по строению. Полипептидная цепь каждого из них образует плотно лежащие петли и формирует структуру типа «бочонка» из 8 цепей, которые удерживаются водородными связями. Между «бочонком» и аминным и карбоксильным концевыми участками белка аминокислотная цепь образует петли, на которых находятся поверхностные антигенные детерминатны вириона, которые вызывают синтез антител, нейтрализующих инфекциозность вируса. Малый внутренний белок VP4 связан с вирусной РНК, участвует во встраивании ее в капсид вириона.

325

Вирус имеет особенности: не содержит гемагглютинина, не культивируется в курином эмбрионе и в организме экспериментальных животных.

Резистентность. Устойчив во внешней среде: в воде, молоке, сточной канализационной воде сохраняет активность при 0°С в течение года, при кислых значениях рН в течение 1-3 часов, имеет плавучую плотность 1,34 г/см3. Так как вирион не имеет оболочки, содержащей липиды, он не повреждается растворителями жиров (этиловым эфиром, хлороформом). Одномолярный раствор хлористого магния защищает полиовирус от тепловой инактивации, что используется для термостабилизации оральной вакцины. При 50°С инактивируется в течение 30 минут, при 20°С – 3 месяца, на овощах сохраняется 20 дней. Вирус быстро погибает в 1% растворе хлорамина, 3% перекиси водорода, чувствителен к УФ-лучам.

Репродукция. Вирусы адсорбируются на липопротеиновых рецепторах клетки, в которую они проникают путем виропексиса – вирус связывается с клеточной мембраной, образуется микровакуоль.

После освобождения вириона от капсида образуется репликативная форма РНК, которая является матрицей для синтеза информационной РНК. Репродукция происходит в цитоплазме. Вначале синтезируется единый гигантский полипептид, который разрезается протеолитическими ферментами на несколько фрагментов. Одни из них представляют капсомеры, из которых строится капсид, другие – внутренние белки, третьи – вирионные ферменты. Далее формируются несколько сотен вирионов в каждой инфицированной клетке, которые освобождаются после лизиса клетки.

Культивирование. В лабораторных условиях вирус культивируют в первичных или перевиваемых культурах клеток различных тканей человека и обезьян. Полиовирус, выделяемый из естествнных источников, способен инфицировать только клетки приматов, содержащие на клеточной поверхности специфические мембранные рецепторы для вируса.

Патогенез и клиника. Источник инфекции – больные люди и вирусоносители. Путь заражения – фекально-оральный, чаще алиментарный или водный. Инкубационный период 7-14 дней. Вирус попадает в носоглотку (лимфоглоточное кольцо Пирогова), далее в лимфатический аппарат тонкого кишечника, а затем проникает в кровь. Из кровяного русла вирус может проникать в ЦНС, если нейтрализующие антитела не вырабатываются в количествах, достаточных для блокирования этого пути. В ЦНС вирус распространяется вдоль нервных волокон и в процессе внутриклеточного размножения может повредить или полностью разрушить нервные клетки, результатом чего может быть вялый паралич. Чаще поражаются клетки передних рогов

326

спинного мозга, в тяжелых случаях вирус проникает в головной мозг. Нарушение функций периферических нервов и двигательной мускулатуры являются следствием размножения вируса в мотонейронах. Изменения в этих клетках развиваются быстро.

Если человек инфицируется вирулентным полиовирусом, могут быть: бессимптомная инфекция, легкие клинические формы без параличей, асептический серозный менингит, паралитический полиомиелит (отмечается в 1% случаев полиовирусной инфекции).

Легкие формы заболевания могут протекать с лихорадкой, головными болями, тошнотой, рвотой, запором, ангиной. В течение нескольких дней больной выздоравливает. Асептический менингит кроме перечисленных признаков может проявляться ригидностью и болями в затылке и спине; болезнь длиться 2-10 дней и заканчивается выздоровлением.

При паралитическом полиомиелите возникает вялый паралич, обусловленный поражением мотонейронов. Некоторое восстановление утраченных функций может произойти в течение 6 месяцев после начала болезни, но остаточные параличи сохраняют постоянный характер.

Иммунитет. После заболевания остается стойкий иммунитет к соответствующему серотипу вируса. Пассивный иммунитет (после рождения) сохраняется в течение 4-5 недель жизни ребенка. Протективными свойствами обладают вируснейтрализующие антитела, которые появляются до появления параличей. Образование антител в ранние сроки инфекции является результатом размножения вируса в кишечном тракте и глубоких лимфатических структурах до внедрения его в нервную систему. Антитела, появившиеся в крови рано, могут предотвратить переход вируса в ЦНС, поэтому вакцинация способна защищать ЦНС, если проводится до появления неврологических симптомов.

Понижение устойчивости к полиовирусной инфекции наступает после удаления миндалин и аденоидов, так как после операции резко снижается уровень секреторных антител в носоглотке.

Лабораторная диагностика

Вирусологический метод – выделение вируса и его идентификация. Материал – фекалии больного (в 1 г фекалий содержится до 1 млн инфекционных доз), реже носоглоточный смыв, кровь, ликвор. Материал фильтруют, обрабатывают антибиотиком, вносят в культуру клеток Hep-2 и RD (из рабдомиосаркомы человека). Использование только двух клеточных линий для лабораторной диагностики полиомиелита позволяет стандартизировать полученные результаты. Через 5-7 дней возникает ЦПД в виде мелкозернистой деструкции клеток.

327

Идентификация вируса проводится в реакции нейтрализации, т. е. в культуры тканей вносят вирус в смеси с поливалентной противополиомиелитной сывороткой типов 1, 2, 3, а затем для определения типа – с отдельными типовыми сыворотками. При идентичности типа вируса и данной сыворотки ЦПД не возникает. Для установления внутритиповых различий между штаммами полиовирусов используют штаммоспецифические адсорбированные поликлональные и моноклональные иммунные сыворотки, молекулярную гибридизацию, полимеразную цепную реакцию и секвенирование вирусного генома.

Для программы ликвидации полиомиелита важное значение имеет дифференциация между штаммами дикого и вакцинного штамма.

Серологический диагноз используют для определения нарастания титра АТ в крови переболевших людей. С этой целью применяют реакцию нейтрализации в культуре ткани с парными сыворотками, полученными в острой стадии болезни и в период реконвалесценции. Ставят РСК, ИФА. При положительном результате выявляют четырехкратное нарастание титра антител во второй сыворотке по сравнению с первой.

Специфическая профилактика осуществляется живыми и убитыми вакцинами, благодаря которым достигнут значительный прогресс в борьбе с полиомиелитом. ВОЗ принято решение о глобальной ликвидации полиомиелита после 2000 г.

Убитая вакцина получена американским ученым Солком в 1953 г. и содержит вирусы полиомиелита 1, 2, 3 типов, выращенные в почечной ткани обезьян. Она вызывает гуморальный иммунитет – образование IgG и IgM, но не препятствует репродукции вирусов в клетках слизистой оболочки кишечника.

Пероральная живая вакцина типов 1, 2, 3, получена в 1956 г.

Сейбиным из аттенуированных штаммов вируса полиомиелита, культивированных в культуре клеток почек африканских зеленых мартышек. Помимо IgG и IgM-антител она индуцирует образование секреторных IgA-антител в слизистой оболочке пищеварительного тракта, особенно тонкого кишечника, и тем самым препятствует циркуляции диких штаммов вируса полиомиелита.

В настоящее время вакцина выпускается в жидком виде, применяется для вакцинации детей, начиная с 3-х месячного возраста, (вводят трехкратно, чтобы создать иммунитет против всех трех типов вируса) с интервалом в 4-6 недель и далее по схеме (в два года и 7 лет).

Для лечения используют сывороточный человеческий иммуноглобулин против полиомиелита, полученный из сыворотки доноров.

Вирусы Коксаки.

328

Выделены в 1947 г. Долдорфом и Сиклсом в местечке Коксаки от больного ребенка с симптомами полиомиелита. В настоящее время известно 30 серотипов Коксаки-вирусов, из них к группе Коксаки А относятся 1-24 серотипа (тип 23 отсутствует), к В – 1-6 серотипы.

Строение вирусов типично для всех пикорнавирусов, но есть следующие особенности: содержат гемагглютинин; патогенны для новорожденных мышей-сосунков. Причем, внутримышечное введение вируса Коксаки А вызывает вялые параличи и участки омертвения мышц, а Коксаки В – поражение внутренних органов и энцефаломиелит.

Клиника. Вирусы вызывают разнообразные по клинике заболева-

ния:

а) герпангину – острую лихорадку с болями в животе, зеве и пузырьковыми высыпаниями на слизистой ротовой полости, иногда с ригидностью затылочных мышц;

б) эпидемическую миалгию – протекает с высокой температурой и колющими мышечными болями в области грудной клетки и живота; в) эпидемическую плевродинию – сопровождается лихорадкой, плевритами, болевыми приступами в области груди (болезнь Борнхоль-

ма);

г) асептический серозный менингит – острая лихорадка с менингеальными симптомами;

д) энцефаломиокардит новорожденных – миокардит и паралитичекие формы, похожие на полиомиелит, кардиотропность больше выражена у вирусов Коксаки В.

В целом для вирусов Коксаки характерен полиорганный тро-

пизм.

Диагностика осуществляется при выделении вируса из фекалий, смыва из носоглотки, ликвора путем заражения материалом мышейсосунков и культур клеток. Для идентификации ставят реакцию нейтрализации в культуре клеток, на новорожденных мышах со специфическими сыворотками.

Серологический диагноз проводят путем выявления нарастания титра антител в парных сыворотках больного в РН, РТГА, ИФА.

Вирусы ЕСНО.

Вирусы ECHO описаны в 1941 г. Эндерсом. Название представляет собой аббревиатуру из первых букв английских слов enteric cytopathogenic human orphans. Так как их роль в патологии человека долго оставалась неизвестной, они были названы «сиротами». Отличаются от других энтеровирусов тем, что не патогенны для новорожденных мышей, имеют гемагглютинин. Известны 1-33 серотипы (кроме 10, 22, 23, 28), которые идентифицируются в реакции нейтрализации, ПЦР, ИФА.

329

Вирусы вызывают различные заболевания преимущественно в детском возрасте. Сродство к лимфоидной ткани – одна из характерных особенностей этих вирусов. После размножения вирусы проникают в лимфу, а затем в кровь, наступает вирусемия и генерализация инфекции. Дальнейшее развитие болезни зависит от свойств вируса, его тканевого тропизма и иммунного статуса организма. Многие серотипы способны поражать ЦНС, вызывая полиомиелитоподобные заболевания, асептический серозный менингит (серовары 2-9, 12, 14, 16, 21), желудочно-кишечные заболевания с синдромом диареи, респираторные заболевания (серовары 8-11, 20), увеит – воспаление слизистой оболочки глаза, заболевания паренхиматозных органов.

Диагностика проводится так же, как и при вирусах Коксаки. Энтеровирус 70 вызывает субконъюнктивальные кровоизлияния

и кератит. Иногда возникают осложнения со стороны ЦНС – боли в области корешков спинномозгового нерва, слабость мышц конечностей, парезы лицевого и языкоглоточного нервов. Основной путь передачи – контактный, реже фекально-оральный.

Энтеровирус 71 по свойствам занимает промежуточное положение между вирусами полиомиелита и нейротропными штаммами вируса Коксаки. Против энтеровируса 71 разработана эффективная инактивированная вакцина.

Специфическая профилактика. Получены положительные результаты при применении формалинизированных вакцин из наиболее патогенных энтеровирусов (Коксаки А-9, В-1, ЕСНО-6).

20.1.4.2. Вирус гепатита А

Морфология и свойства. Вирус гепатита А вызывает эпидемический гепатит. Он имеет сферическую форму, диаметр вириона 27 нм, геном представлен однонитевой (+)РНК с массой 2,6 МД (рис.24). Суперкапсид отсутствует. Тип симметрии кубический (икосаэдр). Капсид имеет 32 капсомера, он образован четырьмя полипептидами (VP1 – VP4). По своим свойствам вирус гепатита А выделен в отдельный род Hepatovirus. В антигенном отношении вирус гепатита А является однородным. Вирус размножается в организме шимпанзе, мармозет.

В настоящее время вирус удается культивировать в культуре клеток почек зеленых мартышек (культура 46 47).

Особенности вируса. Отмечается большая устойчивость к физикохимическим факторам. При 60˚С не утрачивает инфекционную активность в течение 12 часов, при 20˚С сохраняется годами, высокорезистентен к хлору, благодаря чему способен проникать в водопроводную воду через барьеры водоочистных сооружений, при 100˚С разрушается в течение 5 минут.

330