1.2 Определение специфичности лактатдегидрогеназы
Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует превращение пирувата в лактат на последней стадии гликолиза:
|
|
О |
|
|
|
О |
|
|
|
|
|
// |
|
|
|
// |
|
|
|
|
|
СОН |
|
+ |
ЛДГ |
СОН |
|
+ |
|
|
|
|
+ НАДН |
+ Н |
|
+ |
|
НАД |
|
|
|
С = О |
|
|
|
НСОН |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
СН3 |
|
|
|
СН3 |
|
|
|
пируват лактат
Принцип метода.В ходе реакции кофермент НАДН + Н+окисляется до НАД+ и поглощение при 340 нм, характерное для НАДН + Н+, уменьшается. Учитывая коэффициент молярной экстинкции НАДН, равный при 340 нм 6,2210–3, рассчитывают скорости ферментативной реакции в микромолях/мин. Для проверки специфичности ЛДГ можно вместо пирувата использовать другую кетокислоту –оксалоацетат или–кетоглутарат.
Ход работы.В кювету спектрофотометра помещают 1 мл раствора пирувата; 1,7 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,5); 0,2 мл раствора НАДН + Н+и 0,1 мл раствора ЛДГ (или 0,1 мл сыворотки) и измеряют поглощение при 340 нм с интервалом 1 мин в течение 10 минут.
Отдельно измеряют поглощение в пробе, содержащей вместо ЛДГ 0,1 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,5 (контрольная проба). Количество образовавшегося НАД+рассчитывают по разнице между величиной поглощения в контрольной пробе при 340 нм и величиной поглощения в каждый момент времени протекания реакции.
Рассчитывают скорость реакции в микромолях/мин и строят график зависимости скорости реакций от времени, находят начальную скорость ферментной реакции.
Аналогично проводят определение с раствором оксалоацетата и делают вывод о специфичности действия ЛДГ.
Материалы и реактивы: фосфатный буфер, рН 7,5 (см. Приложение В, п.2); раствор ЛДГ в 0,1 М фосфатном буфере, (рН 7,5), 5 мкг в 1мл, или сыворотка как источник ЛДГ; раствор НАДН в 0,1 М фосфатном буфере, 2 мг/мл; раствор пирувата или оксалоацетата 10–3М в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,5.
2 Флавиновые дегидрогеназы
Кофакторами для них являются флавинадениндинуклеотид (ФАД) или флавинмононуклеотид (ФМН). Эти кофакторы являются производными рибофлавина (витамина В2).
|
|
|
О |
|
|
|
NН2 |
|
(ОНСН)3 CН2 О (Р) |
|
(НСОН)3 - CН2 О-Р ОН |
|
|
|
С |
|
CН2 |
|
CН2 О / \\ |
|
|
|
N С N |
|
СН N N |
|
СН N N НО Р=О // |
|
// \ / \ // \ |
|
// \ / \ // \ НС С СН |
|
Н3С С С С С = О |
|
Н3С С С С С = О О \ / \ // |
|
|
|
N N |
|
|
|
Н3С С С С N Н Н2С О |
|
|
|
\\ / \ // \ / |
|
|
|
С N С Н Н |
|
|
|
Н Н |
|
Н О |
|
Н О НО ОН |
|
|
|
|
|
ФМН |
|
ФАД |
Н3С
С
С С N
Н
\\ / \
//
\ /
С N
С
Флавиновые кофакторы прочно связаны с апоферментом, следовательно, являются простетической группой.
В ходе реакции отщепляемые от субстрата атомы водорода присоединяются к изоаллоксазиновой группировке кофактора:
|
Н R |
|
Н R Н |
|
|
|
|
|
С N N |
|
С N N |
|
// \ / \ // \ |
|
// \ / \ / \ |
|
Н3С С С С С = О |
|
Н3С С С С С = О |
|
|
|
+ S |
|
Н3С С С С N Н |
|
Н3С С С С N Н |
|
\\ / \ // \ / |
|
\\ / \ / \ / |
|
С N С |
|
С N С |
|
|
|
|
|
Н О |
|
Н Н О |
|
|
|
|
|
ФАД (или ФМН) |
|
ФАДН2(или ФМН2) |
SН2
+
окисленная форма восстановленная форма
Флавиновые ферменты по типу катализируемой реакции делятся на две группы: первая группа - это ферменты, которые передают водород или электрон промежуточным соединениям, и вторая группа (оксидазы) - которые могут передавать отнятый водород кислороду воздуха.
К первой группе относятся флавопротеины: пируватдегидрогеназа, дегидрогеназа Д - аминокислот (1.4.99.1), сукцинатдегидрогеназа и др.
Ко второй группе - ксантиноксидаза (1.2.3.2.), пируватоксидаза (1.2.3.3.), глюкозооксидаза и др. ферменты.