10. Концентрация фермента

Скорость ферментативных реакций зависит от количества фермента в среде. Когда в среде субстрата достаточно, скорость ферментативной реакции возрастает пропорционально увеличению количества фермента. Графически это выглядит следующим образом (рис. 4.):

V

V- скорость реакции

С- концентрация фермента

С

Рисунок 4 – Зависимость скорости реакции от концентрации фермента

Эта зависимость справедлива только в определённых условиях, например, в начальный период ферментативной реакции, т.к. в этот период практически не происходит обратной реакции, а концентрация продукта оказывается недостаточной для обратимости реакции. Именно в этом случае скорость реакции (точнее, начальная скорость реакции) будет пропорциональна концентрации фермента.

11. Концентрация субстрата

Скорость ферментативной реакции в сильной степени зависит от концентрации субстрата в среде. При низкой концентрации субстрата скорость реакции возрастает пропорционально его концентрации. Однако по мере увеличения концентрации эта пропорциональность нарушается, скорость реакции растёт всё медленнее. Происходит насыщение фермента субстратом, при этом молекулы фермента находятся в форме ES(полное насыщение), скорость реакции становится максимальной (V_m). Очевидно, что при полунасыщении (т.е. когда половина молекул фермента находится в формеES) скорость реакции равна ½V_m.В этом заключается ещё одна особенность ферментативных реакций, не свойственная реакциям, протекающим в отсутствии ферментов. Если ещё дальше повышать концентрацию субстрата, то скорость реакции достигнет постоянного уровня, становится постоянной, не зависящей от концентрации субстрата. В этих условиях фактором, лимитирующим скорость ферментативной реакции, становится концентрация фермента в среде.

Изучение влияния концентрации субстрата на скорость ферментативных реакций позволило Л. Михаэлису и Ментен создать основы теории ферментативной кинетики.Они вывели классическое уравнение, описывающее гиперболическую зависимость в координатах V-[S]; при увеличении концентрации субстрата скорость ассиметрически стремится кV_m:

Одним из основных выводов этой теории является установление константы Михаэлиса, графическое изображение которой представлено на рис.5. Если скорость реакции при высоких концентрациях субстрата достигает некоторой максимальной величины V_m, то концентрация субстрата [S], при которойV=V_m/2, называется константой МихаэлисаK_m, т.е.K_m=[S]. Таким образом, константа Михаэлиса равна концентрации субстрата (моль/л), при которой скорость ферментативной реакции составляет половину от максимальной.

Более низкие значения K_mозначают, что ферментативный катализ происходит более интенсивно.

V

V_m/2V_m

S

V–скорость реакции

K_m – концентрация субстрата,

Рисунок 5– Графическое изображение константы Михаэлиса

Таблица 3 – Значение констант Михаэлиса – Ментен (Кm) для катализа ферментом гексокиназой фосфорилирования сахаров.

Субстрат	Кm, моль/л	Субстрат	Кm, моль/л	Субстрат	Кm, моль/л
Глюкоза	810-6	Аллоза	810-3	Манноза	8,510-6

Как следует из данных таблицы 5, количество глюкозы, необходимое для 50%-го насыщения фермента, в тысячу раз меньше, чем необходимое для 50%-го аллозой. Следовательно, фермент предпочтительнее взаимодействует с глюкозой – он более специфичен к ней (реакция протекает тем быстрее, чем ниже К_m). К_m для маннозы практически равен К_m для глюкозы. Сравнивая структуру субстратов, можно видеть, что отличие аллозы от глюкозы и маннозы, так существенно сказавшееся на величине К_m, и, следовательно, скорости реакции фосфорилирования, обусловлено пространственной ориентацией ОН-группы у третьего (сверху) атома углерода и активного центра фермента, по которому идет образование фермент-субстратного комплекса.