3.2. Методика определения белковых фракций методом электрофореза на бумаге.

ПРИНЦИП МЕТОДА: Метод основан на различии величины заряда белков сыворотки крови. Если нанести каплю сыворотки на полоску хроматографической бумаги, смоченной буферным раствором, и пропустить через эту полоску постоянный электрический ток, отдельные белки будут продвигаться в электрическом поле с различной скоростью. При рН=8,6 белки сыворотки крови движутся по направлению к аноду, поскольку они обладают в этих условиях отрицательным зарядом. Наиболее быстро движутся альбумины, затем 1- и 2-глобулины, далее  - глобулины и наконец  - глобулины.

АППАРАТУРА: Прибор для определения белков в крови методом электрофореза на бумаге состоит из выпрямителя, электрофоретической кюветы и денситометра.

ХОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ:

Кюветы заполняются вероналовым буфером рН = 8,6. Нарезают из хроматографической бумаги полоски длиной 38 см., шириной 3 см., полоски смачивают буферным раствором и помещают в кювету. Ближе к отрицательному полюсу наносится сыворотка (0,01 мл), затем прибор включается в электрическую сеть.

Электрофоретическое разделение белков сыворотки на бумаге производится обычно в течение 6- 24 часов при напряжении 150 Вт и силе тока 6-8 А. По истечении указанного срока бумажные полоски сушат в сушильном шкафу при температуре около 100 градусов в течение 5 мин., затем красят бромфеноловым синим. Остатки красителя, не связавшегося с белками, отмывают с полоски бумаги 10% уксусной кислотой.

Количественное определение белковых фракций проводится с помощью денситометра или путём экстрагирования спиртовым раствором щелочи с последующим определением концентрация краски фотоколориметрически.

Тема: Биохимия крови. Метаболизм гемоглобина. Занятие №2.

Актуальность темы.

Минеральный состав крови чрезвычайно разнообразен и играет большую роль в жизнедеятельности организма, например, в процессе роста и развития ребенка обмен кальция и связанных с ним фосфатов. Снижение содержания кальция может сопровождаться повышением нервно-мышечной возбудимости, судорогами (тетания новорожденных). Развитию гипокальциемии у новорожденных способствует сахарный диабет у матери, недоношенность и т.д. Чрезмерные дозы витамина «Д» вызывают гиперкальциемию с отрицательными последствиями для организма.

Основным белком, осуществляющим снабжение тканей кислородом и освобождение их от углекислоты, является гемоглобин. В связи с этим, изучение обмена гемоглобина и определение его концентрации является чрезвычайно важным, а также актуальным является клиническое значение определения содержания желчных пигментов крови, моче и кале в дифференциальной диагностике различных видов желтух (гемолитическая, желтуха новорожденных, обтурационная, паренхиматозная).

Учебные и воспитательные цели:

Общая цель: привить знания о минеральном составе крови, механизме свертывания крови, метаболизме гемоглобина.

Частные цели:

- уметь определять уровень кальция в сыворотке крови;

- владеть методикой определения концентрации гемоглобина в крови.

1. Входной контроль знаний.

   1. Тесты.

   2. Устный опрос.

2. Основные вопросы темы:

   1. Минеральные составные части крови, значение их для организма.

   2. Механизм свертывания крови.

   3. Противосвертывающая система и система фибринолиза.

   4. Метаболизм гемоглобина. Синтез гема, гемоглобина.

   5. Распад гемоглобина. Прямой (конъюгированный) и непрямой (неконъюгированный) билирубин.

   6. Клиническое значение определения содержания желчных пигментов крови, моче и кале в дифференциальной диагностике различных видов желтух (гемолитическая, желтуха новорожденных, обтурационная, паренхиматозная).

3. Лабораторно-практические работы:

   1. Методика определения кальция в сыворотке крови;

   2. Методика определения концентрации гемоглобина в крови.

4. Выходной контроль.

   1. Ситуационные задачи.

5. Литература:

   1. Материалы лекций.

   2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: Медицина, 1990. С. 582-585, 599-607.

5.3. Биохимия под ред. Е.С. Северина, А.Я. Николаева М.: ГЭОТАР-МЕД, 2011г.