45. Производство моноклональных антител и использование соматических гибридов животных клеток. Гибридомы. Этапы производства моноклональных антител.

Только благодаря использованию моноклональных антител, полученных в результате иммунизации животных лекарствами, стало возможно определение дозы этих лекарств. Такая «иммунодозировка» надежна и экономична. В 1990х гг. в США «Управление по контролю за качеством пишевых продуктов, медикаментов и косметических средств» (РБА) впервые утвердило к продаже коммерческий набор для диагностического скрининга на основе гибридом, предназначенный для установления аллергена.

С помощью моноклональных антител возможно выделение биологически активных веществ (белков, гормонов, токсинов) из сложных смесей. Например, при использовании иммуноадсорбции для очистки интерферона был получен препарат высочайшей степени очистки (до 99 %). Только после одного пассажа через колонку с иммобилизованными моноклональными антителами препарат очищался в 5 000 раз!

Можно использовать моноклональные антитела и в качестве меток для точной идентификации специализированных клеток, например нейронов. Существует также технология использования моноклональных антител для изучения клеточных мембран, позволяющая выделять мембранные белки в чистом виде и измерять их биологическую активность.

Подготовительные этапы перед проведением слияния

Полностью процедура получения гибридом включает в себя следующие этапы: иммунизация животных, подготовка клеток к слиянию, слияние, отбор продуцирующих специфические антитела клонов, клонирование и реклонирование, массовая наработка гибридомных клеток. Обычно вся процедура занимает 3—4 мес.

Приготовление отдельных компонент сред для культивирования. Одной из частых причин неудач при получении гибридом является недостаточно высокое качество сред и реактивов. Поэтому крайне важно перед началом работы обеспечить постоянное снабжение высококачественными реактивами и средами.

Основными средами, употребляемыми при получении гибридом, являются среда RPMI 1640 и среда Игла в модификации Дульбекко. Применяются и другие среды, в частности среда Дульбекко в модификации Искова (эта среда особенно часто используется при иммунизации m vitro). Среды выпускаются в виде готовых растворов, 10-кратных концентратов и сухих порошков. Лучшие результаты получаются при приготовлении сред в условиях лаборатории из сухих порошков, однако при этом важное значение имеет качество воды. Для приготовления сред необходима деионизированная и дважды перегнанная в кварцевой посуде вода.

Все среды и растворы стерилизуются путем фильтрации через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм.

Выбор экспериментального животного. Он определяется наличием родительских миеломных линий, возможностью получения гибридов клеток этих линий и иммунных лимфоцитов, а также способностью к размножению полученных гибридом в организме животного. Обычно для иммунизации используют мышей и крыс. Это связано с тем, что подходящие миеломные клетки мышей и крыс широко распространены и, кроме этого, не представляет сложностей выращивание полученных гибридом в организме этих животных. При иммунизации мышей берут линию Balb/C; это связана с тем, что все имеющиеся миеломные линии, образующие гибридомы, получены от этих мышей. Однако сила иммунного ответа у различных линий мышей может отличаться, и бывают ситуации, когда необходимо иммунизировать мышей другой линии. В этом случае полученные гибридомы выращивают на гибридах FI этой линии и линии Balb/C.

Иммунизация крыс проводится в тех случаях, когда требуется получить антитела к антигенам мыши, для которых отсутствует полиморфизм у разных линий мышей. Полученные гибридомные клетки можно выращивать в организме крыс, если применять миеломные клетки крыс, или в организме мышей после подавления их иммунологической реактивности (см. ниже).

Иммунизация. Назначение процесса иммунизации состоит в том, чтобы увеличить долю клеток, продуцирующих антитела заданной специфичности, и перевести эти клетки в функциональное состояние, при котором они способны сливаться и образовывать антителообразующие гибридные клетки. Как отмечалось выше, до сих пор неизвестно, какие именно клетки способны гибридизироваться с образованием антителообразую-щих гибридом. Экспериментально установлено, что для гибридизации необходимо выделять селезеночные клетки животных через 3—4 сут после последнего введения антигена, т. е. тогда, когда в лимфоидных органах много активно пролиферирующих клеток.

Конкретная схема иммунизации сильно зависит от природы антигена и его иммуногенности. Антигены клеточной поверхности являются сильными иммуногенами, тогда как большинство растворимых белков — слабые иммуногены. В последнем случае необходимо применять различные адъюванты, усиливающие иммунный ответ. Среди адъювантов наибольшее распространение получил полный адъювант Фрейнда (ПАФ). Помимо этого используют введение антигена, преципитироваиного на квасцах, и введение вместе с антигеном убитых клеток Bordetella Pertussis. Обычно антиген вводят неоднократно, что необходимо для развития сильного иммунного ответа, хотя чрезмерная иммунизация может иметь обратный эффект — отмечено, что иногда у клеток гипериммунизированных животных снижается способность образовывать гибридомы. В некоторых случаях бывает достаточно и одной иммунизации.

Приготовление сред для культивирования и получение клеточных суспензий

Приготовление сред для культивирования.

Подготовка миеломных клеток. Необходимо учесть, что клеточные линии изменяются и иногда их способность к слиянию падает или же синтез антител гибридными линиями становится нестабильным. Поэтому лучше иметь не одну какую-то линию клеток, а по крайней мере три. Первые опыты по слиянию нужно провести со всеми линиями, и клетки, которые дали наилучшие результаты, заморозить в достаточном количестве. Успех в получении гибридом в значительной мере определяется правильной подготовкой миеломных клеток.

Клетки питающего слоя. Техника получения гибридом в сущности представляет собой выращивание клеточного потомства из одной клетки, посеянной при очень низкой плотности. Известно, что при низкой плотности рост клеток сильно замедляется и в значительной степени определяется наличием в среде в достаточном количестве различных питательных и стимулирующих факторов. В связи с этим при получении гибридом часто используют клетки питающего слоя (feeder cells), которые снабжают культуру различными жизненно необходимыми факторами. Этот эффект будет проявляться тем сильнее, чем менее оптимальной является среда культивирования. При использовании некоторых партий сывороток и сильно обогащенных сред эффект клеток питающего слоя может и не выявляться.

В качестве клеток питающего слоя используют клетки селезенки, тимоциты, перитонеальные макрофаги, мышиные фибро-бласты и др. В. Лонг и сотрудники (1986) получили очень хорошие результаты при использовании облученных диплоидных фиб-робластов легкого человека (линии IMR-90. MRC-5, WI-38).

Кондиционированные среды. Использование клеток питающего слоя имеет ряд недостатков: 1) их приготовление трудоемко и накладывает определенные ограничения по времени на приготовление гибридом; 2) они представляют собой потенциальный источник бактериального загрязнения; 3) они метаболизируют питательную среду, что создает необходимость часто менять ее; 4) растущие клетки в питающем слое могут перерастать или убивать гибридомы; 5) клетки питающего слоя препятствуют визуальной идентификации растущих колоний гибридом.

Всех этих недостатков лишены кондиционированные среды, представляющие собой супернатанты культур, в которых росли клетки питательного слоя. Кондиционированные среды в культивировании клеток используются давно в качестве средства замены клеток питающего слоя. Для получения гибридом использовались среды, кондиционированные эпителием человека, клетками эндотелия, перитонеальными макрофагами и мышинными фибробластами.

Приготовление суспензии клеток селезенки. Все процедуры выполняют при комнатной температуре.