76.Каротиноиды и их классификация. Схема биосинтеза. Образование из каротина витамина а.

Благодаря изучению физиологии и генетики микроорганизмов— продуцентов витаминов и выяснению путей биосинтеза каждого из них создана теоретическая основа для получения микробиологическим способом практически всех известных в настоящее время витаминов. Однако с помощью энзимов целесообразнее производить лишь особо сложные по строению витамины: β–каротин (провитамин A) и предшественники витамина D. Остальные витамины либо выделяют из природных источников, либо синтезируют химическим путем. Витамины используются в качестве лечебных препаратов, для создания сбалансированных пищевых и кормовых рационов и для интенсификации биотехнологических процессов.

Получение β-каротина. Важное место в обмене вешеств у животных занимает β-каротин, который в печени превращается в витамин A (ретинол). B организме человека и животных каротины не образуются. Основные источники β-каротина для животных — растительные корма; человек получает β-каротин также из продуктов животного происхождения. β-каротин можно выделить из ряда растительных объектов — моркови, тыквы, облепихи, люцерны. B начале 60-х годов XX в. разработана схема микробиологического синтеза β-каротина, которая стала основой промышленного способа его получения. Установлено, что многие микроорганизмы — фототрофные бактерии, актиномицеты, плесневые грибы, дрожжи — синтезируют каротин. Характерно, что содержание β-каротина у микроорганизмов во много раз превышает содержание этого провитамина у растений. Так, в 1 г моркови присутствует всего 60 мкг β-каротина, в то время как в 1 г биомассы гриба Blaneslea trispora — 3 — 8 тыс. мкг. Разработаны опытные установки как периодического, так и непрерывного действия для синтеза β-каротина, основной недостаток которых — высокая стоимость сырья и большая длительность процесса.

77.Проблемы трансформации стероидных структур. Микробиологический синтез гидрокортизона.

В областн превращеиий стероидных соединений достоинства биологичсских катализаторов проявляются наиболсе ярко. Долгое время мнкробиологическая трансформация считалась специфическим методом химии стероидов.

Первые сообіцения о трансформации стероидов микроорганизмами появились задолго до того, как было установлено строение основных представителей стероидов. Еіце в конце XIX в. было известно, что бактериальная флора кишсчника млеколитающих превращает холестерин в копростерин, а холевую кислоту — в дезоксихолевую. К 1913 г. относится открытие полного расщепления холестерина микобактериими. И лишь в 30-х годах, когда была установлена структура основных стероидных гормонов, известных к тому времени, начались попытки применять трансформирующую способность микроорганизмов для препаративного получения этих соединений. В 1948 г. впервыс осущесгвлсно введение гидроксильной группы в молекулу стероида мнкробилогическим путем. Но только после получення -гидроксипрогестерона из прогестерона нри фсрментации последнего с культурой Rhizopus nigricans микробиологические трансформацин стероидов привлекли широкое внимание. Данная трансформация ярко иродемонстрировала преимушества микробиологических методов перед химическими: ввсленне кислородной функции в определенное положение молекулы стероида (С-11) в случае химнческого синтеза представляло необычайно трудную задачу и требовало многочнсленных химических операций, здесь же оно заменялось единсгвенной стадией ферментативного гидроксилирования. Открытие в эти же годы терапевтической ценности кортизона иаряду с указанными успехамн микробиологического процесса гидроксилирования привлекло огромное внимание микробиологов, химиков и врачей к данной области. Внедрение микробиологического синтеза в процеесы получения стероидных гормональных препаратов вызвало переворот в фармацевтической промышленности. по-зволив сразу во много раз удешевить ценные препараты.

Природные стернны — сырье для получення ценных лекар-ственных препаратов.

Большой класс стероидов характеризуется наличнсм в молекуле спсцифического циклического скелета — циклопентанпергидрофенантрена, построенного нз четырех колец, три из которых шесгичленные (А, В и С) и одно - пятичленное (D). Для обозначения различных положений этого кольца принята следу-ющая нумерацня. К стеринам (стеролам) относятся стероиды, несущие в положении С-3 гидроксильную группу.

Холестерин принимает участие в физиологических процессах, пронсходящих в живой клетке, без его участия не может развиваться растущий организм. Желчные камни человека на 99% состоят из холестерина, богаты этим соединснием надпочсчники и другие органы. СпинноЙ мозг и мозг рогатого скота прсдставляст собой наилучший материал для промышленного получения холестерина. Он считался специ-фическим животным стерином до тех пор. пока он не был обна-ружен в некоторых растениях и в морских красных водорослих. Точная структурная формула этого соединения была установлена лишь в 1932 г., хоти впервые он был выделен из жслчных камней в 1782 г.

Другие стерины встречаюшиеся в природе, отличаются от холестерина или по длине боковой цепи, или по степени на-сыщенности.

Стерины растений (фитостерины). Очень важный класс соединений, они служат источником получеиия многих ценных стероидных препаратов.

Ситостерины встречаются в хлопковом и талловом маслах, в зародышах пшеницы и натуральиом каучуке, в сахарном трост-нике и другом растителыюм материале. Коммерческим источ-ником ситостеринов чаще всего являются тростник и хлопковое масло. Ситостерииы и стигмастерин — наиболее перспсктивные и дешевые исходные продукты для получения стсроидных гормонов.

Стсрины необходимы для оеушествления фнзиологических и биохимнческих функний живого организма. Преднолагается, что стсрины требуются для образования мембраиных систем, клеточ-ных оболочек и других етруктуриых образонаний клетки. Есть данные о том, что етерины являются защнтным фактором против токсического действия многих природных соединений.

Основные пути биосинтеза стероидных гормоиов нз холесте-рнна. В органнзме животных и человека из холсетсрииа образуются три важные груипы гормонов: прогестины, половые гормоны н гормопы коры надпочечииков (кортнкостероиды).

При образованин стероидных гормонов из холестерина сначала образуется прегненолон — основной промежуточный продукт бносинтеза стсроидов и кортикостероидов. Окисление З–ОН-груп-пы прегненолона в СО сопровождаетея перемещением двойной связн; продуктом этой кетостероидизомеразной реакции ивляется прогестерон — гормон плаценты и желтого тела.

Прегненолон является также нредшествеиником мужскнх гормоноп (тсстостерона) и жснских половых гормовов (эстроіенов — эстрадиола). В коре надпочечииков прогестерои нревращаетсн в кортнкостерон и кортизол (гидрокор тизон),: секреции кортизола достигает у взроелого человека 15—30 мг в день. Эти веіцества были первоначально выделсны из коры надпочечников в кристаллическом ннде.

Кортилол (гидрокорти.чон) н сго еинтетические аналоги такие, как преднизолон или дексаметазон, нрннадлежит к числу современных средств экстренной терапнн, благодаря их уникаль-ному противовоспалнтелыюму. десенеибилизирующему и пррти-вошоковому действию. По своему химичсскому строению они могут быть разделены на 11-дезоксистероиды, П-гидроксистероиды, 11,17-дигндроксистеронды (к иослсдним относятся кортизои и гидрокортизон).

Основные микробиологические иревращенин стероидов.

Промышлснный сингез названных выше ценных лекарственных препаратов стал возможеи только с развитием методов микробиологической хнмии и, в частноети, мегода микробиологической траисформацші. В качестнс сырья для получения указанных лекарствениыч средств иепользустся диосгенин (из растения диоскореи), стигмастерин из соевых бобоп, в поеледние годы интенсивно изучается р*ситостерин как потенциально дешевый и доступный источник.

.Модифицированные тсм или ішым способом стсроиды сами моіут служить субстратами для ировсдсния соответствующих целенаправленных трансформаций. Так, например, ключевым вешеством в синтезе гидрокортизоиа, кортизона и преднизолона служит «вещество S». Оно, в свою очерсдь, является моднфицированным продуктом биогрансформации моноацетата «вещества R» (2І-ацетат-5-прегнен–ІЗр, 17а. 2І-триол-20-он) с помошыо культуры Corynebacterium mediolanum:

Процесс фермеитативного превраіцення моноацетата веще-ства R в вещество S Рейхштейна с номощью культуры Согуп. mediolanum состоит иэ гидролнза 21-ацстогруппы и окисления Зр-гидроксигруппы в 3 кетогрупну с одновременной миграциеЙ двойной связи. Трансформация заканчивастся практически количествениым выходом веществя S Рейхштейна, носкольку для культуры Coryn. mеdiolanum нехарактерны реакции расщеплепия стероидной молекулы. Это имеет принципиальное значение в производстве кортикостероидных препаратов, поскольку стадия получения вешества S Рсйхштейна является ключевой и в значительной степени определяет конечный выход готовых продуктов следуюших трансформаций.

Вѳедение гидроксильной группы. Микробиологическое гндроксилирование — это наиболее оажный н часто примениемыЙ метод. Наличие гидроксильных групп в 3, II, 16, 17 положениях молекулы стероида, как правило, обусловливает физиологиче-скую активность большинства гормоналыіых стероидных пре-паратов.

Гидроксилнрованне стероидов осуществляется очень многими микроорганизмами, чаще всего грибами, даже конидии некото-рых грибов обладамт гидроксилирующей активностью. Гидроксилирование стероидов ири помощи гриба Rh. nigricans — яркий пример сочетания, специфичности н разнообраэия действия микроорганиэмов.

lla-Гидроксилирование как один из важнейшнх путей получения кортизона изучено наиболее детально и давно применяется в иромышленноети, выходы продуктов трансформации очень высоки, Многие микроорганизмы образуют смесь 11а- и ПрѴ энантомеров, соотношение которых существенно зависйт от фазы развития культуры, как было показано в случае гидроксилирования вещества S Рейхштейна грибом Tieghemella orchidis. j

Ра;іработан метод получения гидрокортизона культурой Г. orchidis из вещества S Рейхштейна в условиях глубиняого культивирования. Наиболыией трансформирующей способноатью обладает 17-часоваи культура, за 10 ч она трансформируе 70% вещестна S Рейхштейна, выход гидрокортизона при составлнет 52%.

Наличие в молекуле стероидов IІр-гидрокетильноЙ, группы обусловливает физиологичсскую активность гидрокортиііна (кортизапа) и преднизолона. Гидрокснлированию подвергакггся субстраты самого различного строения— от производных эетра-на до сложных молекул стеринов, сапогеиннов и т, п. Причина этого - очень широкая субстратная снецифичность гидрокснДаз, которую демонстрируют миогие микроорганизмы. Так опи<|ан іитамм Cunninghamelta btakesteeana, который вводит оксигруііпу в I Ір-положение обшнрного пабора стероидов - различных производных чстрана, теетостерона, кортексолона, прогестерона и т. д.

Получение І4а-гилроксинрогестеронл при помощи Bacitlus cereus является одним из немногих примеров гидрокснлнровання при помоіди бактерий. І5а-Гидроксилированне осуществляется также многими микроорганизмами, основное место среди кото-рых занимают Fusarium и РепісШіит.

Главным препятствием, стоящим на гтути дальнейшего раз-ннтия ііромышленноіо микробнологического гидроксилирования стероидов, так жс как и вообще мнкробиологическнх трансфор-маднй этнх соединений, являетси низкая производительность ферментаиий, иесмотря на высокий продентный выход по суб-страту. Это обусловлено. с одной стороны, нерастворимостью стероидных субстратов в воде. с другой — токсичностью раство-рителей, применяемых при внесении стероида и невозможно-стью использовання высоких концентраций субстрата.

Дегидрогетаацин стероидов. Наличие двойиых связей корен-ным пбразом влияст на физиачогическую активность препаратов. Используя эту реакцию. получают такис эффсктнвные прсна-раты, как преднизолон. Чаще всего микроорганизмы дегидри-руют паіожения 1,2 и 4,5, но описано н введение двойной связи в положения 7,8; 8,9; 9.11; 16,17; 17,20. Реакции дегидрогени-зации осуществляют бактерии и актиномицсты, особенно часто это микоформы Arthrobacter, Corynebacterium, Nocartlia. Широ-кая субстратная специфичность дегидрогеназ показана на боль-шом эксперимеитальиом материале; она позволяет использовать в качестве субстратов ацетаты стероидов, которые являются полупродуктамн во многих технологических схемах получения стероидов. Напрнмер, Mycobacterium globiforme 193, дегидри-рующая 1,2-связь в кортизоне, так же эффсктивно превращает и кортизонацетат в преднизонацстат с выходом 86%. Исслсдо-вание показало, что для этой культуры характерна макснмальная удельная трансформирующан активность в период снижения уделыюй скорости роста.

Реакция дегидрогенизации позволяет получать преднизолон из корти.чона, дианабол и.ч метилтестостерона, преднизолон из гидрокорти.чона. Продукты 1,2-дегидрирования образуютси с пы-сокими выходами до 86%. Распространенность этой реакции объясняется ые только наличием соответствующих дегидрогеиаз у болыпого числа микроорганизмоп. но и химичсскими свой-ствами данного участка стсроидной молекулы, ее нсстабиль-ностью, особенно при наличии кетогруппы в 3-м положении и (или) двойной связи 4,5. Этими свойствами стероидной молекулы обънсняется и доступность связн 1,2 для микробиых оксидоре-дуктаз. Во многих случаях показака обратимость реакций дегидрогенизации и восстановления.

Микробиологическое восстаноѳление. Этот процесс использу-ется в меньшей степени, чем дегидрирование. Он осущесгвляется главным образом дрожжами и аназробнымн бактериямн, прел-ставителими микрофлоры кишечника млекопитающих, осущест-вляющими превратение холестерина в копростерин:

Описаны процессы насыщения двойных связей также и аэроб-ными культурами, широко известными как окислители — актино-мицетами, микоформамн и даже грибамн. ІІапример, культура Aspergillus fltivus восстанавливает ароматическое кольцо неко-торых стероидов:

Окисление гидроксильной группы в кетогруппу - одна из наиболее частых реакций, осуществляемых микроорганизмами (бактериими, актиномицетами, грибами). Наиболылий практиче-ский интерес представляют окислителыіые превращения гидро-ксильных групп у 3,17 и 20-го атомов стероидной молекулы. Окисление гидроксила в 3-м іюложении легко осуществляется у соедннений с ненасыщенным кольцом А, а также при наличии двойной связи в положении 4. К этому же типу окислителыіых превращсний относят введение кетогруппы в молекулу стероида.