Экспрессия генов Патрушев

431

репликации хромосом. Следует, однако, иметь в виду, что на ранних эмбриональных стадиях развития Xenopus контроль репликации ослаблен, и число зон начала репликации значительно больше, чем в соматических клетках. Нормальный контроль репликации устанавливается после увеличения продолжительности клеточного цикла на стадии средней бластулы.

В нормальных соматических клетках не все центры репликации одновременно начинают синтез ДНК. Некоторые из них функционируют в ранней, а некоторые в поздней S-фазе клеточного цикла. Такая дифференциальная репликация хромосом является важным регуляторным механизмом, обеспечивающим локальную организацию хроматина и активность генов. Аналогичное явление обнаружено в клетках дрожжей, где функционирование во времени центров репликации зависит от положения хромосом в ядре.

432

ГЛАВА 5. ЗАЩИТА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ

Существование биологических видов, а следовательно, и феномена жизни как такового целиком зависит от точности передачи генетической информации как по вертикали – от организмов-родителей потомкам, так и по горизонтали – от одной соматической клетки к другой в процессе онтогенетического развития многоклеточных организмов. В предыдущей главе были рассмотрены основные механизмы функционирования главной генетической системы, обеспечивающей воспроизведение генетической информации путем удвоения молекул ДНК, – системы репликации, точность функционирования которой поражает воображение. Для правильной передачи генетической информации исключительно важны и молекулярные механизмы, обеспечивающие расхождение удвоившихся хромосом между дочерними клетками у про- и эукариот, в последнем случае при митозе и мейозе. Однако ни одна из существующих генетических систем не работает безошибочно. Поэтому не менее важную роль в жизнедеятельности организма играет его система репарации (исправления) ошибок, случайно возникающих при репликации ДНК и после ее завершения.

У проблемы точности передачи генетической информации в ряду поколений клеток и организмов имеется и другая сторона. Чрезмерная консервация генетической информации, заключенной в отдельных генетических локусах, может быть вредной для организма и вида в целом. В частности, одним из механизмов, лежащих в основе возникновения разнообразия антител, являются запрограммированные изменения генов иммуноглобулинов, которые закрепляются в геноме лимфоцитов в результате их отбора в онтогенезе. Высокий темп изменений некоторых генетических локусов у паразитических организмов, например у трипаносом, в результате которых меняется структура антигенных детерминант на поверхности их клеток, необходим для их выживания, так как помогает этим организмам избежать нейтрализующего действия иммунной системы организма-хозяина. Другим хорошо известным примером такого рода является генетическая изменчивость вируса гриппа. Наконец, абсолютный консерватизм в передаче генетической информации по вертикали сделал бы невозможным филогенетическое развитие организмов, их

433

эволюционные преобразования, приведшие, в конечном счете, к тому разнообразию биологических видов, которое сегодня наблюдается в природе. Эволюционно сложившиеся отношения между точностью функционирования вышеупомянутых генетических систем и частотой ошибок, возникающих при воспроизведении генетической информации отдельных генетических локусов, четко сбалансированы между собой, и уже установлено, что в ряде случаев являются регулируемыми. Запрограммированные и случайные наследуемые изменения генома, называемые мутациями, могут сопровождаться колоссальными количественными и качественными изменениями в экспрессии генов.

5.1. Мутации

Мутации – это наследуемые изменения структуры генома. Поскольку основу любого генома составляют нуклеиновые кислоты – ДНК или РНК, то под действием мутаций происходит, прежде всего, изменение структуры геномных нуклеиновых кислот. Процесс возникновения мутаций, основанный на различных механизмах, называют мутагенезом. В зависимости от факторов, вызывающих мутации, последние принято разделять на спонтанные и индуцированные. Считается, что спонтанные мутации возникают самопроизвольно на протяжении всей жизни организма в нормальных для него условиях окружающей среды. При этом широкое распространение получило мнение о том, что спонтанные мутации в эукариотических клетках возникают с частотой 10-9–10-12 на нуклеотид за клеточную генерацию. Теперь, однако, становится ясно, что такие цифры не отражают реальности. Они не учитывают того факта, что частоты спонтанных мутаций могут существенно (на несколько порядков) изменяться от локуса к локусу и, скорее всего, указывают на нижний предел частоты мутаций в отдельных наиболее стабильных участках генома.

Индуцированными мутациями называют наследуемые изменения генома, возникающие в результате тех или иных мутагенных воздействий в искусственных (экспериментальных) условиях или при неблагоприятных воздействиях окружающей среды. Среди важнейших мутагенных факторов, прежде всего, необходимо отметить химические мутагены – органические и неорганические вещества, вызывающие мутации, а также ионизирующее излучение. При детальном рассмотрении спонтанных и индуцированных

434

мутаций становится ясно, что между этими двумя типами нет существенных различий. Действительно, большинство спонтанных мутаций возникает в результате мутагенного воздействия, которое их индуцирует, но не регистрируется экспериментатором. На более прочном фундаменте находится классификация мутаций, в которой учитываются молекулярные процессы, лежащие в основе их возникновения.

В классификации, основанной на размерах сегментов генома, подвергающихся преобразованиям, мутации разделяют на геномные, хромосомные и генные. При геномных мутациях у организма-мутанта происходит внезапное изменение числа хромосом, кратное целому геному. Если через 2n обозначить число хромосом в исходном диплоидном геноме, то в результате геномной мутации, называемой полиплоидизацией, происходит образование полиплоидных организмов, геном которых представлен 4n, 6n и т.д. хромосомами. В зависимости от происхождения хромосом в полиплоидах различают аллополиплоидию, в результате которой происходит объединение при гибридизации целых неродственных геномов, и аутополиплоидию, для которой характерно адекватное увеличение числа хромосом собственного генома, кратное 2n.

При хромосомных мутациях происходят как изменение числа отдельных хромосом в геноме (анеуплоидия), так и крупные перестройки структуры отдельных хромосом. Последние получили название хромосомных аберраций. В этом случае наблюдаются потеря (делеции) или удвоение части (дупликации) генетического материала одной или нескольких хромосом, изменение ориентации сегментов хромосом в отдельных хромосомах (инверсии), а также перенос части генетического материала с одной хромосомы на другую (транслокации) (крайний случай – объединение целых хромосом).

На генном уровне изменения первичной структуры ДНК генов под действием мутаций менее значительны, чем при хромосомных мутациях, однако генные мутации встречаются более часто. В результате генных мутаций происходят замены, делеции и вставки одного или нескольких нуклеотидов, транслокации, дупликации и инверсии различных частей гена. В том случае, когда под действием мутации изменяется лишь один нуклеотид, говорят о точковых мутациях. Поскольку в состав ДНК входят азотистые основания только двух типов – пурины и пиримидины, все точковые мутации с заменой

435

оснований разделяют на два класса: транзиции (замена пурина на пурин или пиримидина на пиримидин) и трансверсии (замена пурина на пиримидин или наоборот). Из-за вырожденности генетического кода могут быть три генетических последствия точковых мутаций: сохранение смысла кодона (синонимическая замена нуклеотида), изменение смысла кодона, приводящее к замене аминокислоты в соответствующем месте полипептидной цепи (миссенс-мутация) или образование бессмысленного кодона с преждевременной терминацией (нонсенс-мутация). В генетическом коде имеются три бессмысленных кодона: амбер – UAG, охр – UAA и опал – UGA. В соответствии с этим получают название и мутации, приводящие к образованию бессмысленных триплетов (например амбер-мутация).

По влиянию на экспрессию генов мутации разделяют на две категории: мутации типа замен пар оснований и типа сдвига рамки считывания (frameshift). Последние представляют собой делеции или вставки нуклеотидов, число которых не кратно трем, что связано с триплетностью генетического кода. Первичную мутацию иногда называют прямой мутацией, а мутацию, восстанавливающую исходную структуру гена, – обратной мутацией, или реверсией. Возврат к исходному фенотипу у мутантного организма вследствие восстановления функции мутантного гена нередко происходит не за счет истинной реверсии, а вследствие мутации в другой части того же самого гена или даже другого неаллельного гена. В этом случае возвратную мутацию называют супрессорной. Генетические механизмы, благодаря которым происходит супрессия мутантного фенотипа, весьма разнообразны.

5.1.1. Основные источники мутаций и методы определения мутагенной активности

В основе мутаций на молекулярном уровне лежат две основные причины: ошибки репликации и мутагенные воздействия различной природы. Ошибки репликации возникают из-за того, что точность функционирования ДНКполимераз не является абсолютной. Поскольку выбор очередного нуклеотида для включения в растущую цепь ДНК определяется в результате взаимодействия белков и ферментов системы репликации и матричной ДНК, изменение свойств этих белков или матрицы как спонтанно, так и под действием различных модифицирующих агентов может приводить к ошибкам в

436

репликации ДНК и мутациям.

Ошибки репликации. Как уже обсуждалось в разделе 4.1, синтез ДНК происходит в результате последовательного ферментативного присоединения дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, комплементарных матричной ДНК, к 3’- концевому нуклеотиду растущей цепи ДНК. Точность этого процесса определяется различиями в свободной энергии у канонических или ошибочных пар азотистых оснований ДНК, образующихся по правилам Уотсона–Крика в водных растворах. Различия составляют 1–3 ккал/моль и обеспечивают точность репликации в пределах не более одного ошибочно включенного нуклеотида на каждые 100 нуклеотидов.

Генетические методы определения частоты ошибок репликации, возникающих в процессе синтеза ДНК in vitro, бывают двух типов. При одном подходе измеряют частоту прямых мутаций, приводящих к инактивации какоголибо гена, изменение которого легко определить фенотипически. Удобной системой, основанной на таком принципе, является репликативная форма ДНК бактериофага M13mp2, содержащая часть гена β-галактозидазы в виде одноцепочечной бреши, застраивающейся испытуемой ДНК-полимеразой в бесклеточной системе. Ошибки синтеза ДНК в этом случае выявляют по потере или уменьшению активности β-галактозидазы, что не отражается на жизнеспособности бактериофага, который образуется после введения такой ДНК в бактериальные клетки с помощью трансфекции. С применением этого метода обнаруживают до 200 различных замен оснований, а также делеции, мутации со сдвигом рамок считывания и сложные генные перестройки.

При другом подходе к определению точности синтеза ДНК in vitro измеряют частоту обратных мутаций, восстанавливающих (под действием точковой мутации) последовательность нуклеотидов гена, активность белкового продукта которого была нарушена в результате, например амбер-мутации. Этот метод обладает большой чувствительностью, позволяя определять мутации, происходящие с частотами 10-6–10-8 на нуклеотид за одну генерацию. Однако он ограничен возможностью определения мутаций лишь одного конкретного типа.

Частота ошибок репликации увеличивается из-за спонтанных повреждений геномной ДНК, возникающих в результате ее депуринизации в

437

физиологических условиях. Депуринизация является следствием разрыва N- гликозидной связи, соединяющей в молекуле ДНК пуриновые основания с остатками дезоксирибозы. По оценкам Линдаля и Ниберга депуринизация ДНК в организме происходит с частотой 3 10-11 на нуклеотид в секунду, что в 100 раз выше частоты спонтанной потери пиримидиновых оснований ДНК в тех же условиях. Простой расчет показывает, что при такой частоте этих событий в соматической клетке человека должно происходить ~105 депуринизаций/день. Репликативный комплекс на ДНК-матрице взаимодействует с апуринизированным сайтом и включает в синтезируемую цепь ДНК преимущественно остатки дезоксиаденозина.

Многие бактериальные и эукариотические ДНК-полимеразы, осуществляющие репликацию ДНК, обладают 3’→5’-экзонуклеазной корректирующей активностью, и поэтому ошибочно включенные нуклеотиды, некомплементарные матрице, удаляются с 3’-конца растущей цепи ДНК перед включением следующего нуклеотида в строящуюся цепь ДНК. Наличие у ДНКполимеразных комплексов такой активности существенно повышает точность функционирования систем репликации.

Мутагенные воздействия. Усилий систем репликации становится недостаточно в стрессовых ситуациях, когда организм подвергается массированному мутагенному воздействию. Однако даже присутствие незначительного количества мутагенов в окружающей среде вызывает непрерывное накопление мутаций в геноме соматических клеток, хотя и с небольшой скоростью. Процесс накопления мутаций, избежавших коррекции системами репарации, является кумулятивным – к ранее существовавшим мутациям неуклонно добавляются новые, и суммарное количество мутаций в геноме (генетический груз) возрастает. Процесс накопления мутаций – статистический, поэтому в настоящее время можно предсказывать лишь вероятность возникновения конкретной мутации в генетическом локусе или геноме организма. Поскольку мутации часто являются причиной наследственных и приобретенных заболеваний, важно делать статистический прогноз частоты возникновения определенных заболеваний в популяциях, для которых известна мутагенная экологическая обстановка.

Ионизирующее излучение. Ярко выраженным мутагенным действием обладают коротковолновое электромагнитное излучение (УФ-свет,

438

рентгеновские лучи), а также элементарные частицы, образующиеся в процессе радиоактивного распада вещества. С помощью рентгеновского излучения Г. Меллером в 1927 г. впервые были получены мутации у дрозофилы. С тех пор исследования механизмов мутагенеза проводятся все интенсивнее и в широких масштабах.

Электромагнитное излучение, проходящее через вещество, или элементарные частицы передают свою энергию атомам. В результате первичного столкновения с квантами излучения или частицами из атома, который превращается в положительно заряженный ион, выбиваются электроны. Освобожденные электроны вторично вызывают образование пар ионов при перемещении до тех пор, пока их энергия не иссякнет и они не утратят свою ионизирующую способность. Единицей дозы излучения служит рентген (Р) – количество излучения, которое вызывает образование 2·109 пар ионов/см3 воздуха. На практике часто пользуются единицей рад, служащей мерой поглощения энергии; в воздухе 1 Р эквивалентен 0,876 рад. Для объяснения механизмов возникновения мутаций под действием ионизирующего излучения была применена ранее разработанная теория мишени, в соответствии с которой повреждение ДНК наблюдается в том месте, где имеет место первичная ионизация. Реакция происходит внутри дискретного объема, являющегося мишенью. Повреждения ДНК возникают как вследствие прямого попадания кванта излучения или элементарной частицы в молекулу, так и в результате вторичного действия иона, образовавшегося за пределами ДНК в некоем "чувствительном объеме". Установлено, что частота мутаций, возникающих у дрозофилы и других объектов, прямо пропорциональна дозе облучения. Определенная доза облучения вызывает одинаковое число мутаций как при однократном, так и при дробном облучении небольшими порциями.

Химические мутагены экзогенного происхождения. Многие химические соединения, встречающиеся в окружающей среде, обладают способностью взаимодействовать с ДНК или с ее низкомолекулярными предшественниками и вызывать мутации. При этом одни химические соединения изначально являются реакционноспособными мутагенами, непосредственно соединяющимися с ДНК и изменяющими ее химическую структуру, а другие, так называемые промутагены, для превращения в мутагены сначала претерпевают метаболическую активацию под действием

439

ферментативных систем организма.

Одним из наиболее обширных классов химических мутагенов экзогенного происхождения являются алкилирующие агенты, под действием которых происходит спонтанный (без участия ферментативных систем организма) перенос алкильных групп этих химических соединений на биологические макромолекулы, в том числе и ДНК. В табл. I.18 представлены основные классы алкилирующих агентов. В структурах химических соединений, приведенных в таблице, можно выявить различия по двум признакам, роль которых в мутагенной активности алкилирующих агентов была неоднократно подтверждена экспериментально. Один из признаков относится к типу переносимых алкильных групп: метильной, этильной или более сложной. Другой отличительный признак – число алкильных групп, которые отдает одна молекула алкилирующего агента. Это свойство называется функциональностью соединения. Так, среди азотистых ипритов H2NCH2CH2Cl

– монофункционален, HN(CH2CH2Cl)2 – бифункционален, а N(CH2CH2Cl)3 – трифункционален.

Главным источником мутаций, возникающих под действием алкилирующих агентов, является алкилирование O-6 в гуанине и O-4 в тимине ДНК. Другими сайтами, алкилирование которых реже приводит к мутациям, могут быть N-3 гуанина, N-1, N-3 и N-7 аденина, N-3 цитозина, а также N-3 и N-4 тимина. При этом спектр мутаций, возникающих под действием любого алкилирующего агента, как правило, специфичен. Следует отметить, что благодаря функционированию репаративных систем клетки к возникновению мутаций приводит лишь небольшая часть алкилирований ДНК. Поэтому частота реакций между алкилирующим агентом и ДНК не связана простой зависимостью с их мутагенной активностью. То же самое относится не только к алкилирующим агентам, но и к другим мутагенам.