Экспрессия генов Патрушев

422

1 – отстающая цепь реплицирующейся ДНК синтезируется с использованием фрагментов Оказаки, содержащих на 5’-концах РНКзатравки (зачерненные прямоугольники); 2 – по завершении синтеза затравки удаляются и фрагменты лигируются с образованием бреши на 5’- конце вновь синтезированной цепи ДНК, прилегающем к концу хромосомы

4.3.1. Линейные хромосомы бактерий

Афоризм Жака Моно: "То, что верно для E. coli, – верно и для других бактерий (слона)" получил широкое распространение. К счастью, на деле все обстоит не так скучно. До недавнего времени общепринятым было представление о кольцевой структуре бактериальных хромосом. Однако в 1989 г. была впервые описана у спирохеты Borrelia burgdorfery линейная бактериальная хромосома, которую идентифицировали с помощью электрофореза в импульсном электрическом поле. Размер этого генома составлял всего 960 т.п.о. Вскоре было обнаружено, что линейная и кольцевая хромосомы сосуществуют одновременно у Agrobacterium tumefaciens, а у грамположительных бактерий рода Streptomyces, обладающих одним из самых больших бактериальных геномов ( 8000 т.п.о.), имеется одна линейная хромосома. Представитель актиномицетов Rhodococcus fascians также, повидимому, обладает линейной хромосомой. Линейные хромосомы у бактерий часто сосуществуют с линейными плазмидами и широко распространены в природе.

Линейные хромосомы и плазмиды наиболее хорошо изученных бактерий рода Streptomyces содержат концевые инвертированные повторы (terminal inverted repeats – TIRs), с которыми ковалентно связаны концевые белки (TP). Несмотря на то что подобные структуры характерны для хромосом аденовирусов и бактериофага φ29 Bacillus subtilis, механизм репликации хромосом стрептомицетов существенно отличается от такового вирусных геномов. Если у вирусов синтез ДНК инициируется на конце хромосомы с использованием в качестве затравки TP, ковалентно связанного с нуклеотидом, и продолжается через весь геном до его конца, то репликация хромосомы и линейных плазмид стрептомицетов начинается с внутренней области начала репликации oriC. Синтез ДНК распространяется в обе стороны от области начала репликации по стандартному полуконсервативному механизму и

423

завершается на концах линейных молекул ДНК с образованием 3’-концевых брешей (рис. I.50,а). Наиболее простым решением проблемы заполнения этой бреши могла бы быть прямая инициация репликации теломерных участков хромосом с TP-белка, ковалентно связанного с инициирующим нуклеотидом, что имеет место у аденовирусов (см. рис. I.50,б). Действительно, стрептомицеты используют ТР для репликации теломерных участков, однако механизм распознавания теломер в данном случае существенно отличается. В настоящее время рассматриваются три модели заполнения брешей в теломерных участках линейных хромосом бактерий.

Рис. I.50. Модель достройки теломерных участков хромосом и плазмид Streptomyces

а – структура теломеры после репликации: верхняя цепь ДНК полностью реплицирована, в нижней имеется одноцепочечная брешь, обозначены четыре палиндромные последовательности нуклеотидов; б – маловероятный механизм с участием концевого белка и ДНК-полимеразы; в–д – альтернативные модели репликации, основанные на других механизмах. 1 – концевой белок, 2 – ДНК-полимераза, 3 – палиндром, 4 – родительская цепь ДНК, 5 – дочерняя цепь, 6 – репаративный синтез

В соответствии с первой моделью одноцепочечный участок теломеры, содержащий TIR-последовательность, образует концевую шпильку путем

424

комплементарных взаимодействий нуклеотидов внутренних участков бреши и 3’-концевых нуклеотидов (см. рис. I.50,в). В этом случае синтез ДНК, репарирующий одноцепочечную брешь, инициируется на двухцепочечном участке, образованном палиндромными последовательностями I-IV, с участием ТР и ДНК-полимеразы и продолжается вдоль 3’-концевого одноцепочечного участка хромосомы. Согласно второй модели ТР инициирует репликацию на полностью двухцепочечной дочерней ДНК, вытесняя 5’-концевую цепь родительской ДНК, с которой связан ТР (см. рис. I.50,г). Вытесняемая цепь далее спаривается с выступающим 3’-концом хромосомы, после чего такая разветвленная структура разрешается с помощью гомологичной рекомбинации. Эта модель предполагает участие в заполнении брешей белка RecA (для переноса цепи ДНК) и продуктов генов ruv (для разрешения структуры Холидея), что подтверждается генетическими данными. В третьей модели одноцепочечный палиндром I образует шпильку, 3’-конец которой служит затравкой для синтеза ДНК, в результате которого заполняется брешь (см. рис. I.50,д). ТР образует одноцепочечный разрыв напротив первоначального 3’- конца, который является затравкой для последующего синтеза ДНК. В результате шпилька разворачивается и восстанавливается структура теломеры. Эта модель аналогична модели "катящейся шпильки", предложенной для объяснения механизма репликации генома парвовирусов. В данной модели роль ТР отличается от его функций в качестве белка-затравки в рассмотренных выше примерах.

Неизвестно, как много форм линейных бактериальных хромосом существует в природе. Не изучены и таксономические проблемы, связанные с топологией хромосом в царстве эубактерий. Если каждый тип хромосом характерен для отдельного таксономического домена, то можно предполагать, что топология хромосом играет важную роль в эволюции бактерий. Альтернативно топологические взаимопревращения хромосом могут быть относительно частыми событиями, а линейные и кольцевые хромосомы присутствуют только у близких видов бактерий. Нестабильность хромосом стрептомицетов (образование протяженных делеций и амплификация последовательностей нуклеотидов) недавно стали связывать с перестройками в их концевых участках, часть из которых сопровождалась образованием кольцевых хромосом. Таким образом, эволюционная роль топологии

425

бактериальных хромосом может быть определена только в результате будущих исследований.

4.3.2. Репликаторы эукариот

Хромосомы эукариот содержат линейные молекулы ДНК, а следовательно, остаются все те же проблемы, связанные с их репликацией, которые обсуждались в связи с воспроизводством линейных хромосом бактерий. Однако проблемы, которые эукариотическим клеткам необходимо решить при редупликации своих хромосом, несомненно серьезнее, так как размер заключенной в них ДНК значительно превышает размеры хромосомных ДНК бактериальных клеток. Кроме того, в связи с многоклеточностью большинства эукариот возникает необходимость более тонкой координации репликации ДНК в отдельных полностью дифференцированных и дифференцирующихся клетках, что является одной из основных целей регуляции клеточного цикла у данных организмов. В связи с этим организация репликации ДНК у эукариот характеризуется рядом существенных особенностей.

Рис. I.51. Структура репликаторов дрожжей S. cerevisiae

Обозначено взаимное расположение различных регуляторных элементов в репликаторах ARS1, ARS307 и ARS305. ACS – каноническая последовательность ARS, DUE – ДНК-расплетающий элемент. Подстрочные индексы указывают на принадлежность регуляторных элементов соответствующим репликаторам

Инициация репликации у эукариот происходит на специфических множественных последовательностях нуклеотидов – репликаторах. Наиболее изученными являются репликаторы дрожжей S. cerevisiae, впервые

426

идентифицированные как автономно реплицирующиеся последовательности

(ARS – autonomously replicating sequence), способные поддерживать внехромосомную репликацию плазмид в дрожжевых клетках. Исследование структуры ARS1 показало, что этот хромосомный элемент состоит из нескольких коротких регуляторных последовательностей. Аналогичная организация характерна и для других ARS дрожжей (рис. I.51). В частности, ARS307 в дополнение к канонической последовательности ACS, общей для всех ARS, содержат еще два элемента – B1 и B2, которые необходимы для выполнения репликатором своих функций in vivo. Несмотря на то что эти последовательности в разных репликаторах не строго консервативны, внутри групп (B1, B2 и т.п.) они функционально взаимозаменяемы. Изменение положения по отношению к ACS предотвращает их функционирование.

Первым этапом инициации репликации у дрожжей является взаимодействие регуляторных последовательностей репликатора, по крайней мере, с шестью различными белками, которые образуют комплекс, распознающий область начала репликации ORС (origin-recognition complex). ARS определяет место инициации репликации в клетках дрожжей. Элемент B3 ARS1 взаимодействует с белком Abf1, который стимулирует репликацию доменом, характерным для белков-активаторов транскрипции, тогда как B1 взаимодействует с ORC. Остающиеся регуляторные последовательности области начала репликации дрожжей образуют ранее неизвестный элемент,

названный ДНК-расплетающим элементом DUE (DNA-unwinding element),

который, как полагают, облегчает раскручивание цепей ДНК при инициации репликации. Точковые мутации в элементе B2 не влияют на функции репликатора, что является общим свойством структурных элементов, тогда как мутации в ACS, B1 и B3 нарушают инициацию репликации, как и следовало ожидать от регуляторных элементов нуклеиновых кислот, взаимодействующих с белками.

Исследования репликаторов у дрожжей S. pombe показали, что область начала репликации ura4 включает в себя три отдельных репликатора, которые располагаются на участке ДНК длиной в 5 т.п.о. У млекопитающих области начала репликации располагаются на расстоянии 100 т.п.о. друг от друга; часть их уже удалось клонировать и изучить на молекулярном уровне. Установлено, что синтез ДНК в отдельных репликонах происходит по двум

427

направлениям, причем перемещение репликативной вилки осуществляется предпочтительно в одном направлении, которое может изменяться в зависимости от стадии развития организма и уровня экспрессии генов, содержащих репликаторы. Частота использования отдельных репликаторов изменяется в онтогенезе, уменьшаясь в клетках взрослого организма. Сравнение первичных структур шести отдельных репликаторов эукариот показало, что все они содержат DUE-элементы, участки прикрепления к ядерному матриксу (SAR/MAR), канонические ARS-последовательности дрожжей, пиримидиновые тракты, а также ранее неидентифицированную каноническую последовательность WAWTTDDWWWDHWGWHMAWTT, где W = A/T, D = A/C/T, H = A/C/T, a M = A/C. Имеются отдельные сообщения о том, что в репликаторах животных присутствуют пуриновые тракты, канонические последовательности, взаимодействующие с факторами транскрипции и белками репликативного комплекса, энхансерный октамерный мотив, сайты связывания продуктов онкогенов, AT-богатые последовательности и участки перегибов (bent) ДНК. В настоящее время до конца непонятно, какое непосредственное отношение имеют все эти регуляторные последовательности к инициации репликации ДНК. Предполагается, что многие из них участвуют в регуляции транскрипции (а следовательно, и регуляции экспрессии генов) как таковой, поскольку большинство из известных в настоящее время репликаторов локализованы в 5’-концевых последовательностях функционирующих генов.

4.3.3. Репликация теломерных участков эукариотических хромосом

Исследование механизмов репликации теломерных участков эукариотических хромосом показало, что они принципиально отличаются от механизмов репликации центральных областей ДНК. Изучение этих механизмов длительное время сдерживалось тем, что в клетках животных количество хромосом, а следовательно, и теломерных участков, невелико – они составляют лишь небольшую часть от всех остальных последовательностей. Прорыв произошел в 1978 г., когда в качестве объекта исследований Е. Блэкберн стала использовать простейшее жгутиковое – Thetrahymena, в клетках которого содержатся тысячи линейных хромосом. Было установлено, что теломеры тетрахимены построены из коротких повторяющихся

428

последовательностей. Вскоре стало ясно, что такая структура характерна для теломерных участков хромосом всех исследованных эукариот. В частности, у человека теломеры содержат единственный повтор GGGTTA. Длина ДНК в теломерах хромосом человека варьирует и в клетках зародышевой линии составляет 10–15 т.п.о, а в лейкоцитах периферической крови – 5–12 т.п.о. У дрожжей длина теломер приближается к 300 п.о., и они составлены неидентичными повторами C1-3A/TG1-3. Таким образом, для теломерных участков хромосом характерна значительная гетерогенность в разных клетках и тканях даже одного организма. Еще более разительными оказываются межвидовые различия в размерах теломер – от 50 п.о. в клетках жгутиковых до 50 т.п.о. у одного из видов мышей.

Рис. I.52. Механизм функционирования теломеразы

Изображено комплементарное взаимодействие внутренней матричной молекулы РНК теломеразы с ДНК теломерного участка хромосомы

Синтез теломерных последовательностей ДНК осуществляется специальными ферментами – теломеразами, для которых нет аналогов среди других известных нуклеотидилтрансфераз. Особенностью этих ферментов является присутствие у них в качестве составной части короткого фрагмента РНК – компонента, абсолютно необходимого для их функционирования и

429

служащего матрицей при синтезе теломерных последовательностей хромосом (рис. I.52). Комплементарное взаимодействие внутренней РНК теломеразы с 3’- концевым выступающим одноцепочечным сегментом ДНК хромосомы инициирует синтез теломерных последовательностей. При этом 3’-концевой фрагмент ДНК служит затравкой для удлинения этой ДНК на РНК-матрице. После удлинения (элонгации) выступающей цепи ДНК до конца матрицы происходит транслокация фермента на один теломерный повтор вперед относительно матрицы с освобождением последовательности матричных нуклеотидов, после чего он готов для вступления в следующий цикл элонгации только что добавленной 3'-концевой последовательности хромосомы. После завершения удлинения одноцепочечной 3'-концевой теломерной последовательности вторая цепь ДНК достраивается обычным способом. Таким образом происходит решение "проблемы отстающей цепи ДНК" при репликации ДНК у эукариот.

Наличие у животных тканеспецифичности в распределении теломер по размерам, а также изменение размеров этих последовательностей в онтогенезе предполагают существование механизмов, регулирующих данный процесс. Создается впечатление, что для активной пролиферации клеток теломерные последовательности не должны становиться короче определенного порогового размера. Недавние исследования обнаружили резкое повышение активности теломераз, характерное для опухолевых клеток, что служит в настоящее время чувствительным физиологическим маркером их злокачественного перерождения. В этой связи сегодня в качестве одного из подходов к терапии опухолей рассматривают подавление активности теломераз, функционирование которых, как полагают, необходимо для иммортализации клеток и роста опухолей. Именно благодаря таким свойствам теломеразы в последнее время вызывают особый интерес, что сопровождается расширением исследований в данной области молекулярной генетики.

4.3.4. Пространственная организация синтеза ДНК у эукариот

Пространственная организация репликативного синтеза ДНК у эукариот является одним из наиболее ярких примеров внутриядерной компартментализации генетических процессов. Анализ локализации мест синтеза ДНК в ядрах млекопитающих с использованием импульсной метки

430

бромдезоксиуридина или биотинилированного dUTP обнаруживает всего 150 мест включения этих предшественников (центров репликации), которые приблизительно равномерно удалены друг от друга. Во время инициации синтеза ДНК размер этих центров мал, и они обнаруживаются в виде небольших четко очерченных "точек", которые со временем становятся более диффузными. В данных центрах репликации происходит аккумуляция белков, участвующих в синтезе ДНК: ДНК-полимеразы α, PCNA и RP-A, а также регуляторных молекул типа циклина А, cdk2 и RPA70. Иммунохимическими методами с использованием частиц коллоидного золота было показано, что растущие цепи ДНК выходят из центров репликации. Это позволяет предполагать, что во время репликативного синтеза цепи ДНК перемещаются через фиксированные внутри ядра структуры аппарата репликации. Такая внутриядерная компартментализация синтеза ДНК позволяет концентрировать регуляторные, структурные и ферментативные компоненты, участвующие в репликации и поддержании пространственной структуры хромосом. Ступенчатая сборка функционально активных элонгирующих комплексов в микрокомпартментах ядра предоставляет большие возможности для регуляции инициации репликативного синтеза ДНК.

Роль ядерных пространственных структур в обеспечении функциональных свойств ДНК можно рассмотреть на примере репликации хромосом в ооцитах Xenopus laevis. Инъекция прокариотической ДНК в ооциты или ее добавление к экстрактам ооцитов сопровождается образованием псевдоядер, компетентных в отношении репликации ДНК. Репликация в таких системах пространственно упорядочена: она происходит в дискретных участках ДНК, содержащих кластеры репликативных вилок. При этом наблюдается замечательная корреляция между числом и пространственным распределением центров репликации в искусственных псевдоядрах и ядрах культивируемых клеток, находящихся в S-фазе. Следовательно, сборка функционирующих комплексов, способных инициировать репликацию, не находится в строгой зависимости от последовательностей нуклеотидов ДНК хромосом, но в большой степени зависит от внутренней пространственной структуры ядра и может эффективно происходить даже на прокариотических ДНК. Это означает, что пространственная структура ядра может непосредственно контролировать его функции, в данном случае – инициацию