Экспрессия генов Патрушев

391

от 5’-конца к 3’-концу строящейся цепи, и синтезированная молекула ДНК антипараллельна по отношению к ДНК-матрице. Репликация ДНК осуществляется по полуконсервативному механизму. Это означает, что одна из цепей дочерних молекул ДНК является частью родительской молекулы ДНК, а другая является вновь синтезированной.

Как и в случае биосинтеза других макромолекул клетки, процесс репликации условно разделяют на три основных этапа: инициацию, элонгацию и терминацию. Чтобы молекулы ДНК-полимераз могли начать синтез ДНК, им необходима затравка (праймер) – короткий олигодезоксирибонуклеотид или олигорибонуклеотид, комплементарный соответствующему участку ДНКматрицы, у которого на конце имеется свободная 3’-ОН-группа. Неспособность молекул ДНК-полимераз самостоятельно без затравки начинать синтез ДНК принципиально отличает эти ферменты от других ферментов матричного синтеза – РНК-полимераз.

В соответствии с моделью Жакоба и соавторов (1963 г.) репликоном называют молекулу ДНК, способную к автономной репликации. Репликон содержит все необходимые гены и регуляторные последовательности, которые обеспечивают регулируемое удвоение его ДНК. Участок репликона, в котором начинается репликация, получил название репликатора или области начала репликации (replication origin) (у E. coli – oriC). При инициации репликации

инициатор, кодируемый репликоном (у E. coli – белок DnaA), взаимодействует с репликатором.

4.1.1. Белки, участвующие в репликации ДНК

Процесс репликации ДНК осуществляется с участием множества белков, которые образуют сложный и эффективно работающий репликативный комплекс. В табл. I.16 представлены основные белки и ферменты, входящие в состав репликативного комплекса прокариотических и эукариотических организмов, и указаны их основные функции.

392

Таблица I.16

Белки, входящие в состав репликативных комплексов прокариотических и эукариотических организмов

Белки в организмах

393

Таблица I.16 (окончание)

Белки в организмах

E. coli Фаг Т4 Вирус SV40 / Функции компонентов комплексов человек

394

В табл. I.16 включены белки наиболее хорошо изученных систем репликации: E. coli и ее бактериофага Т4, а также вируса SV40, размножающегося в культивируемых клетках человека (использованы общепринятые сокращения). При рассмотрении таблицы видно, что основные компоненты системы репликации ДНК в филогенезе функционально консервативны, и любой белковый компонент системы прокариот имеет свой прототип в системе репликации ДНК млекопитающих. Принимая во внимание только этот факт, можно ожидать наличие значительного сходства в механизмах репликации ДНК прокариотических и эукариотических организмов. Более удивительным представляется то, что у белков разных организмов, выполняющих одинаковые функции, в большинстве случаев отсутствует гомология в аминокислотных последовательностях. В частности, не обнаружено сходства у белка SSB (single-stranded DNA binding protein) E. coli,

белкового продукта гена 32 фага Т4 и белка RPA (replication protein A) репликативной системы человека. То же самое характерно и для β-

субъединицы ДНК-полимеразы III (Pol III) E. coli (β-белок), белка 45 фага Т4 и

белка PCNA (proliferating cell nuclear antigen) человека. Это указывает на возможность выполнения одних и тех же функций полипептидными цепями с разными аминокислотными последовательностями, а также на вероятное конвергентное эволюционное происхождение таких белков и их функций из разных неродственных белков-предшественников.

4.1.2. Репликативная вилка E. coli и бактериофага T4

Во время редупликации ДНК ее дочерние синтезирующиеся цепи расходятся из точки репликации, образуя Y-подобную структуру, называемую репликативной вилкой. Именно в окрестностях этой точки разветвления и локализован функционирующий репликативный комплекс. Современные представления о строении репликативной вилки E. coli схематически изображены на рис. I.46,а. В соответствии с этой моделью, ДНК-хеликаза перемещается в репликативной вилке впереди ДНК-синтезирующего белкового комплекса и расплетает цепи родительской ДНК, причем SSB-белок связывается с образующимися одноцепочечными участками, облегчая процесс расплетения.

395

Рис. I.46. Схема функционирующей репликативной вилки E. coli и эукариот и основных этапов репликации ДНК

а – репликативная вилка с основными белками репликации, в которой димер ДНК-полимеразы синхронно реплицирует обе цепи ДНК; б – этапы репликации (1–8) отстающей цепи ДНК. Этап 7 у эукариот является гипотетическим

Из-за антипараллельности и комплементарности цепей ДНК механизм репликации этих двух цепей существенно различается. Действительно, ДНКполимераза обладает способностью синтезировать ДНК только в одном направлении: от 5’-конца к 3’-концу, перемещаясь вдоль ДНК-матрицы в направлении 3’→5’. В то же время комплементарные цепи ДНК противоположно

396

направлены (антипараллельны), и в силу своих свойств ДНК-полимераза не может реплицировать молекулу ДНК, просто перемещаясь от одного конца матричного дуплекса к другому. Для разрешения этого противоречия репликативный комплекс использует изящный механизм. На одной цепи ДНК синтез новой цепи происходит непрерывно, и образующаяся цепь называется ведущей, тогда как синтез другой цепи осуществляется прерывисто в виде коротких фрагментов, получивших название фрагментов Оказаки в честь ученого, впервые их открывшего. Эта вновь синтезируемая цепь ДНК называется отстающей. И хотя фрагменты Оказаки также синтезируются в направлении 5’→3’, перемещение работающей ДНК-полимеразы вдоль матричной цепи ДНК при синтезе каждого индивидуального фрагмента Оказаки должно быть противоположным тому, которое имеет место в случае синтеза ведущей цепи. Образующиеся фрагменты Оказаки отстающей цепи далее соединяются друг с другом с помощью ДНК-лигазы.

Репликативный комплекс, который осуществляет синтез ведущей цепи ДНК, включает в себя минимальный (кор-) фермент ДНК-полимеразы III (белок 43 в случае фага Т4), подвижный связывающий β-белок с молекулярной массой

41 кДа ("sliding clamp", белок 45 у фага Т4) и белки γ-комплекса, состоящего из пяти полипептидов γδδ‘χψ (скрепляющие белки – brace proteins).

Функциональным аналогом белков γ-комплекса у бактериофага Т4 служит комплекс белковых продуктов генов 44/62. При облучении клеток E. coli УФсветом в них индуцируется синтез укороченного β*-белка (26 кДа), который является продуктом того же гена, что и β-субъединица холофермента ДНК-

полимеразы III. По-видимому, функциональная роль β*-белка заключается в обеспечении репликации ДНК на матрице, поврежденной УФ-светом.

При синтезе ведущей цепи ДНК репликативный комплекс E. coli функционирует весьма эффективно с высокой процессивностью. Напомним, что мерой процессивности является длина фрагмента вновь синтезированной макромолекулы, которую комплекс (или индивидуальные ферменты) способен образовывать в одном цикле, не диссоциируя от матрицы. Установлено, что холофермент ДНК-полимеразы III, в состав которого входят минимальный фермент (субъединицы α, θ и ε), β-белок, белки γ-комплекса и τ-белок, синтезирует ведущую цепь ДНК длиной в 50000 нуклеотидов со скоростью >500

397

нуклеотидов в секунду в одном цикле, ни разу не диссоциируя от ДНК-матрицы. Точность репликации ДНК холоферментом ДНК-полимеразы III поражает воображение. Частота ошибочных включений нуклеотидов не превышает 10-9– 10-10 на нуклеотид за один раунд репликации. В то же время очищенные каталитические субъединицы реплицируют ДНК с пониженной точностью. В частности, изолированная α-субъединица допускает ошибки в опытах in vitro с

частотой 6 10-1 на нуклеотид за один раунд репликации. Частота ошибок, возникающих в ДНК, облученной УФ-светом, одна и та же в ведущей и отстающей цепях вновь синтезируемой ДНК in vivo.

Роль γ-комплекса заключается в распознавании РНК-затравок

(праймеров) на матричной ДНК. γ-Комплекс связывается с единственным праймером ведущей цепи ДНК или с каждым из праймеров фрагментов Оказаки отстающей цепи, что, в свою очередь, делает возможным присоединение к промаркированным таким образом праймерам минимального фермента ДНКполимеразы и β-белка (см. рис. I.46,б).

Две молекулы β-белка входят в состав репликативного комплекса вслед за белками γ-комплекса, связываясь с ДНК позади белков γ-комплекса и оставляя 3’-конец праймера доступным для ДНК-полимеразы. Димер β-белка образует кольцо вокруг молекулы ДНК и стимулирует АТРазную активность белков γ-комплекса. Как уже упоминалось выше, функциональный аналог β- белка – продукт гена 45 бактериофага Т4, образует такую же пространственную структуру, охватывающую молекулу ДНК тремя молекулами. Молекулярная масса белка 45 составляет 2/3 от таковой β-мономера, и их аминокислотные последовательности негомологичны друг другу. Тем не менее, четвертичные структуры этих полипептидов и механизмы их функционирования обладают большим сходством.

β-Белки и белки γ-комплекса, будучи связанными с дуплексом праймер– матрица, обеспечивают присоединение к этому комплексу минимального фермента ДНК-полимеразы. Затем ДНК-полимераза при наличии доступных четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, используя праймер для инициации синтеза ДНК, с высокой эффективностью синтезирует цепь ДНК, комплементарную ДНК-матрице. Те же самые белки участвуют и в синтезе отстающей цепи ДНК. В этом случае прерывистый синтез ДНК многократно

398

инициируется на большом количестве праймеров, и ДНК синтезируется в виде фрагментов Оказаки длиной ~1000 нт. Синтез затравок, представляющих собой короткие последовательности РНК, обеспечивает продукт гена dnaG (белок 61 фага Т4). ДНК-полимераза начинает элонгацию цепей ДНК, присоединяя первый дезоксирибонуклеозидмонофосфат к 3’-концевому нуклеотиду РНКзатравки. В процессе элонгации участвуют β-белок и белки γ-комплекса, которые перемещаются вдоль молекулы ДНК вместе с каталитической субъединицей ДНК-полимеразы.

Ведущая и отстающая цепи ДНК реплицируются координированно, что обеспечивается димеризацией ДНК-полимеразных комплексов. В таком димере, который образуется при участии τ-белка, один ДНК-полимеразный комплекс осуществляет непрерывный синтез ведущей цепи ДНК, а другой – фрагментов Оказаки отстающей цепи. Для димеризации ДНК-полимеразы III E. coli необходим τ-белок, в то время как продукт гена 43 бактериофага Т4, повидимому, изначально находится в виде димера. Другое различие репликативных комплексов E. coli и фага Т4 заключается в том, что холофермент ДНК-полимеразы E. coli (субъединицы αεθ·γδδ‘·χψ·τ·β)

сохраняется в виде стабильного комплекса и в отсутствие ДНК, тогда как холофермент Т4-ДНК-полимеразы существует только в присутствии матрицы.

Необычность ситуации во время синтеза ДНК в репликативной вилке заключается в том, что один и тот же белковый комплекс осуществляет как высоко процессивный непрерывный синтез ведущей цепи ДНК, так и прерывистый синтез фрагментов Оказаки отстающей цепи, претерпевая во втором случае периодическую диссоциацию от матрицы для инициации синтеза ДНК с каждого нового праймера. Для объяснения такого парадокса предположили, что холофермент ДНК-полимеразы способен узнавать 5’-конец каждого РНК-праймера, встречающегося после завершения синтеза очередного фрагмента Оказаки во время образования отстающей цепи ДНК в процессе репликации. Недавно с помощью оригинального экспериментального подхода удалось решить этот вопрос. В участок полипептидной цепи β-белка, контактирующий с минимальным ферментом ДНК-полимеразы III, методами генной инженерии ввели аминокислотную последовательность, узнаваемую и фосфорилируемую протеинкиназой. Измеряя скорость фосфорилирования этих

399

сайтов в условиях избытка протеинкиназы во время синтеза ДНК in vitro, определили кинетику ассоциации и диссоциации комплексов β-белок–ДНК- полимераза по изменению уровня защищенности сайтов фосфорилирования от действия протеинкиназы. Полученные результаты интерпретировали таким образом, что во время связанного с синтезом фрагментов Оказаки перемещения минимального фермента ДНК-полимеразы и γ-комплекса вдоль одноцепочечной ДНК-матрицы, покрытой SSB-белком, оба белка прочно связаны с β-белком и матрицей. При встрече репликативного белкового комплекса с дуплексом, образованным матричной ДНК и РНК-затравкой, β- белок остается связанным с вновь синтезированной ДНК, а у отделившихся ДНК-полимеразы и белков γ-комплекса появляется возможность вступить в новый цикл синтеза фрагмента Оказаки путем взаимодействия с очередным дуплексом РНК-затравка–матрица. При этом вхождение ДНК-полимеразы в новый репликативный комплекс облегчается наличием в нем β-белка и белков

γ-комплекса, ассоциированных с очередным РНК-праймером. Таким образом, холофермент ДНК-полимеразы III обладает способностью распознавать молекулярное окружение, создаваемое матричной ДНК, осуществлять терминацию синтеза ДНК при наличии сигнала в виде дуплекса ДНК–затравка и реинициировать синтез ДНК на следующем праймере. В итоге одна и та же молекула ДНК-полимеразы III в составе реплицирующего комплекса способна проводить синтез всех фрагментов Оказаки отстающей цепи реплицируемой ДНК, последовательно осуществляя инициацию, терминацию и реинициацию синтеза каждого из них.

После очередной терминации синтеза ДНК отстающей цепи 3’-конец вновь синтезированной ДНК оказывается вплотную приближенным к 5’-концу праймера следующего фрагмента Оказаки. Для соединения двух фрагментов с помощью ДНК-лигазы необходимы предварительное удаление РНК-праймера и достройка цепи ДНК в образующейся бреши. РНК-затравка удаляется с помощью РНКазы H, нуклеазы, специфически расщепляющей РНК в ДНК–РНК- гибридах, и(или) с участием 5’→3’-экзонуклеазы ДНК-полимеразы I. Во втором случае одновременно с удалением праймера происходит застройка образующейся бреши той же ДНК-полимеразой. В итоге два соседних фрагмента Оказаки вплотную приближаются друг к другу и оказываются

400

отделенными лишь одноцепочечным разрывом, который может репарироваться ДНК-лигазой. В настоящее время остается открытым вопрос о механизмах координации удаления РНК-праймеров из фрагментов Оказаки с самим процессом репликации ДНК.

Кроме вышеупомянутых дуплексов праймеры–ДНК, холоферменты бактериальных и фаговых ДНК-полимераз, по-видимому, способны адекватно реагировать на другие стерические препятствия, возникающие на пути следования вдоль реплицируемой молекулы ДНК. В частности, ДНКполимераза фага Т4 в процессе репликации может расходиться с транскрибирующими ту же ДНК молекулами РНК-полимеразы, не диссоциируя из репликативного комплекса и не вытесняя РНК-полимеразу с матрицы. Кроме того, репликативный комплекс может распознавать повреждения ДНК, возможно, маркированные специфическими белками, и прекращать репликацию соответствующего участка, останавливаясь или диссоциируя от матрицы. Репликация таких участков ДНК возобновляется после ликвидации повреждений ферментами репаративной системы. Для диссоциировавшей ДНК-полимеразы это становится возможным благодаря тому, что 3’-конец вновь синтезированной цепи ДНК в месте остановки репликации остается связанным с β-белком, который облегчает повторное вхождение диссоциировавшей ДНК-полимеразы в репликативный комплекс.

4.1.3. Особенности функционирования репликативной вилки эукариот

Механизмы репликации ДНК у высших эукариот менее изучены из-за их большей сложности. Основные результаты получены на модельной системе с ДНК вируса SV40, в которой процесс репликации исследовали в зараженных клетках человека, культивируемых in vitro. В этой системе вирусный белок, называемый Т-антигеном, выполняет многие функции, необходимые для репликации вирусной ДНК. Во-первых, он является белком-инициатором, необходимым для инициации репликации; во-вторых, он обладает ДНКхеликазной активностью, т.е. расплетает цепи реплицируемой ДНК перед работающей ДНК-полимеразой, и, в-третьих, Т-антиген необходим для правильного взаимодействия с ДНК ферментного комплекса, синтезирующего праймеры (праймосомы). Тем не менее, вирус SV40 использует для репликации