Экспрессия генов Патрушев

371

ошибочным прочитыванием UAG-кодона глутаминил-тРНК. Терминирующий кодон UGA в том же положении декодируется как аргининовый, цистеиновый или триптофановый. Поскольку обычные терминирующие кодоны нормальных клеточных генов в этих условиях не супрессируются, делается вывод, что для осуществления супрессии терминирующий кодон должен находиться в определенном контексте. Запрограммированная супрессия терминирующих кодонов обнаружена, кроме того, у мРНК запасных белков растений, а также при трансляции геномной РНК вирусов растений. В последнем случае этот механизм используется для синтеза полипептидов РНК-зависимой РНКполимеразы и удлинения белка оболочки.

Использование вышеописанных механизмов генетически запрограммированного сдвига рамки считывания транслируемой РНК или супрессии бессмысленных кодонов расширяет кодирующий потенциал геномов без физического увеличения их размеров. Еще более тонкий механизм изменения первоначальной генетической информации на уровне трансляции функционирует при введении в полипептидные цепи некоторых белков остатков селеноцистеина.

3.5.Синтез белков, содержащих остатки селеноцистеина

Спомощью своеобразного механизма осуществляется передача генетической информации от генов к полипептидным цепям селенопротеинов с необычным аминокислотным остатком – селеноцистеином, входящим в их состав. У бактерий и млекопитающих известно более десяти ферментов, в состав активных центров которых входит остаток селеноцистеина, содержащего, в отличие от цистеина, атом селена вместо атома серы. Так, у E. coli гены форматдегидрогеназ H, N или O имеют в одной рамке считывания с кодирующей последовательностью нуклеотидов триплет TGA. Этому триплету в мРНК соответствует бессмысленный кодон UGA, на котором у подавляющего большинства других мРНК E. coli происходит терминация трансляции. Оказалось, что именно кодон UGA в мРНК вышеупомянутых генов кодирует селеноцистеин.

Встраивание этого аминокислотного остатка в полипептидные цепи регулируется весьма тонким механизмом. Перенос остатка селеноцистеина к рибосомам у E. coli осуществляется с помощью специальных молекул тРНК

372

(тРНКSec), которые на первом этапе соединяются с остатком L-Ser при участии серил-тРНК-синтетазы. Образовавшаяся серил-тРНКSec далее в результате многоступенчатого процесса под действием селеноцистеилсинтазы превращается в селеноцистеил-тРНКSec. Селеноцистеилсинтаза обладает высокой специфичностью и не взаимодействует с другими изоакцепторными серил-тРНК бактериальных клеток. Именно селеноцистеил-тРНКSec в процессе трансляции распознает в мРНК кодон UGA, но лишь в определенном контексте: для правильного узнавания UGA-кодона как осмысленного важна последовательность длиной в 45 нуклеотидов, расположенная вслед за UGAкодоном. Кроме того, для правильного узнавания UGA-кодона селеноцистеилтРНКSec необходимо участие белкового продукта гена selB, который является гомологом фактора элонгации трансляции EF-Tu и обладает высоким сродством именно к селеноцистеил-тРНКSec, но не к серил-тРНКSec. К тем же результатам, хотя и с использованием другого, не вполне понятного механизма, приводит встраивание в полипептидные цепи остатков селеноцистеина у млекопитающих.

Рассмотренный пример показывает, что при необходимости живой организм может изменять смысл стандартного генетического кода. В этом случае генетическая информация, заключенная в генах, кодируется более сложным образом. Смысл кодона определяется лишь в контексте с определенной протяженной последовательностью нуклеотидов и при участии нескольких высокоспецифических белковых факторов. Данный пример поновому освещает понятие гена и смысл заключенной в нем генетической информации и не является единственным в своем роде.

Описано изменение смысла антикодона в тРНК путем посттранскрипционной модификации остатка цитозина с образованием так называемого лизидина. В этом случае происходит ферментативное присоединение Lys к гетероциклу цитидина в положении 2. В результате образовавшееся модифицированное основание – лизидин распознается как уридин, что изменяет специфичность антикодона модифицированной тРНК. Другое U-подобное азотистое основание – 5-карбамоилметилуридин (U*), обнаружено в антикодоне тРНКPro (U*GG), хотя в соответствующем гене этот антикодон детерминирован последовательностью CGG. По-видимому, здесь происходит посттранскрипционное дезаминирование цитозина с последующей

373

его гипермодификацией.

Таким образом, во всех приведенных примерах живым организмам недостаточно генетической информации, заключенной в их генах, для ее полноценной реализации в фенотипе. Пока не понятны причины, по которым организм избегает прямого кодирования соответствующих последовательностей нуклеотидов в своих генах, а предпочитает создание требуемых последовательностей в РНК путем посттранскрипционных модификаций первичных транскриптов. Такие факты меняют наше традиционное представление о генах как первичных носителях генетической информации.

3.6. Посттрансляционная регуляция экспрессии генов

Синтезом полноценного полипептида в результате трансляции кодирующей его мРНК рибосомами обычно завершается процесс передачи генетической информации от генов к белкам как у бактерий, так и у высших организмов. Однако в большинстве случаев при синтезе конечного белкового продукта эукариотическими клетками используются различные его модификации, в результате которых он и приобретает требуемые свойства.

Кроме того, необходимо иметь в виду, что конечный уровень содержания конкретных белков в клетке зависит не только от скорости их биосинтеза рибосомами, но и от скорости внутриклеточной деградации. Поэтому дифференциальная регуляция стабильности белков является важнейшим механизмом, регулирующим экспрессию генов у любого организма.

Вэтом разделе рассмотрены примеры посттрансляционных модификаций полипептидов, которые необходимы для получения физиологически активных пептидов или белков, т.е. завершения полноценной экспрессии конкретных генов.

3.6.1.Последствия фолдинга вновь синтезированных полипептидных цепей

Впроцессе трансляции растущие полипептидные цепи начинают приобретать высокоспецифическую пространственную структуру, которая формируется полностью вскоре после завершения их биосинтеза. Процесс сворачивания полипептидной цепи в правильную пространственную структуру

374

получил название фолдинга. В результате фолдинга в водных растворах у водорастворимого полипептида уменьшается свободная энергия, гидрофобные остатки аминокислот упаковываются преимущественно внутрь молекулы, а гидрофильные остатки располагаются на поверхности белковой глобулы. Гидрофобные области образуются и на внешней поверхности молекул белков, формируя полости активных центров, а также места контактов субъединиц мультимерных белков друг с другом и биологическими мембранами. Увеличение гидрофобности поверхности белков снижает их внутриклеточную стабильность, так как множество протеолитических ферментов гидролизуют с большой скоростью пептидные связи, образуемые гидрофобными аминокислотами или находящиеся вблизи от них.

Опасность протеолитической деградации для растущей полипептидной цепи возникает сразу после ее появления на поверхности транслирующей рибосомы. Установлено, что 1/3 вновь синтезированных полипептидных цепей претерпевает протеолитический распад сразу же после завершения их синтеза рибосомами. Большинство вновь синтезированных белков избегает подобной участи благодаря образованию так называемого комплекса NAC (nascent polypeptide associated complex), ассоциированного с растущими полипептидными цепями. Имеется группа белков с молекулярными массами 21–33 кДа, которые взаимодействуют как с такой цепью, так и с самой рибосомой, предохраняя растущий полипептид от деградации путем формирования NAC. Когда же гидрофобная сигнальная последовательность синтезируемого белка достигает длины в 70 аминокислотных остатков и покидает NAC, с ней взаимодействует комплекс белков SRP (signal recognition particle), который не только предохраняет гидрофобную часть растущего полипептида от ранней деградации протеиназами, но и направляет ее к месту назначения – к мембранам эндоплазматического ретикулума.

Растущие полипептидные цепи, у которых отсутствует сигнальная последовательность, покидая NAC, взаимодействуют с обеспечивающей фолдинг системой, в состав которой входят, в частности шапероны Hsp70 и Hsp40. Эти белки теплового шока (Hsp – heat shock protein), образуя комплекс с растущей полипептидной цепью, предотвращают их неспецифическую агрегацию и деградацию под действием внутриклеточных протеиназ, способствуя их правильному фолдингу, происходящему с участием других

375

шаперонов. С другой стороны, Hsp70 принимает участие в ATP-зависимом разворачивании полипептидных цепей, делая неполярные участки полипептидных цепей доступными действию протеолитических ферментов.

Различные сигнальные последовательности аминокислотных остатков обеспечивают направленную доставку вновь синтезированных белков к внутриклеточным органеллам и микрокомпартментам. Они же оказывают влияние на характер фолдинга, посттрансляционные модификации и метаболическую стабильность. Существуют, по крайней мере, пять биохимических процессов с участием вновь синтезируемых белков, контролируемых сигнальными последовательностями аминокислотных остатков. К ним относятся: транслокация белка через плоскость мембраны; внутриклеточный перенос белка без пересечения плоскости мембраны; химические модификации белка без гидролиза пептидных связей; расщепление некоторых или даже всех пептидных связей в белке; конформационные и иные пространственные изменения белков, включая фолдинг и олигомеризацию полипептидных цепей.

Время существования внутриклеточных белков может различаться на несколько порядков. Структурные и конститутивно экспрессирующиеся белки обычно обладают большой продолжительностью жизни. Напротив, регуляторные белки, как правило, быстро распадаются. Протеолитический гидролиз регуляторных белков, который может точно регулироваться, позволяет эукариотической клетке быстро переключаться с одной функциональной программы на другую. По времени полужизни белки животных разделяют на четыре группы: 1) очень быстро обновляющиеся белки (время полужизни – < 1 ч): белок-супрессор опухолей p53, продукты протоонкогенов c- fos и c-myc, орнитиндекарбоксилаза, циклины; 2) быстро обновляющиеся белки (время полужизни – 1–24 ч): тирозинаминотрансфераза, триптофан-2,3- диоксигеназа, γ-глутамилтрансфераза, Hsp70, РНК-полимераза I, рецептор инсулина, убиквитин; 3) медленно обновляющиеся белки (время полужизни – 1–5 дней): каталаза, калпаины, катепсины, протеасомы, тубулины, актины, альдолаза, лактатдегидрогеназа, аргиназа; 4) очень медленно обновляющиеся белки (время полужизни – >5 дней): митохондриальная фумараза, цитохромы b и c, миозин, гемоглобин, гистоны в интерфазном ядре, эластин, коллаген.

Большинство внутриклеточных белков заканчивают свое существование

376

в результате протеолитического гидролиза, превращаясь в небольшие пептиды и свободные аминокислоты, которые далее утилизируются в синтезе новых белков. Многие протеолитические ферменты используют в качестве субстратов индивидуальные белки, проявляя тем самым высокую специфичность. Тем не менее, в клетке имеется и множество протеиназ широкой субстратной специфичности, чья неразборчивость в субстратах компенсируется их строгой компартментализацией. Они локализованы в лизосомах и вакуолях, где гидролизуют любые белки после их попадания в эти органеллы. Такая компартментализация протеолитических ферментов является жизненно важным условием существования клетки. Система протеолитической деградации внутриклеточных белков с участием протеасом и убиквитина отличается от вышеописанных систем тем, что, обладая широкой субстратной специфичностью, она безопасна для окружающих белков и реагирует на регуляторные воздействия. Ниже будет рассмотрено функционирование некоторых из этих систем.

3.6.2. Специфические протеиназы в посттрансляционном процессинге белков

Одним из характерных примеров специфического действия протеиназ является активация предшественников (зимогенов) протеолитических ферментов (трипсина и химотрипсина) после их переноса от места синтеза (поджелудочная железа) к месту функционирования в пищеварительном тракте. Активация происходит вследствие протеолитического отщепления части полипептидной цепи зимогена, приводящего к появлению у укороченного полипептида требуемой ферментативной активности. Необходимость в посттрансляционной регуляции активности зимогенов очевидна – таким путем организм защищает клетки, синтезирующие протеолитические ферменты, от разрушения этими же ферментами.

Аналогичный механизм посттрансляционной активации используется во время биосинтеза инсулина и других пептидных гормонов. Предшественник инсулина синтезируется в виде длинного полипептида с тремя дисульфидными связями. Полипептид приобретает активность гормона только после протеолитического отщепления центральной части полипептидапредшественника и избыточной N-концевой аминокислотной последовательности. Две оставшиеся части предшественника, удерживаемые

377

дисульфидными связями, составляют активную молекулу инсулина.

В системах биосинтеза адренокортикотропного гормона (АКТГ) и эндорфина несколько небольших пептидных гормонов синтезируются в виде одного полипептида-предшественника. Дальнейшая судьба предшественника зависит от типа клеток, в которых он синтезируется. В клетках передней доли гипофиза этот полипептид расщепляется с образованием АКТГ, γ-липотропина и β-эндорфина, причем АКТГ является конечным продуктом протеолиза и может секретироваться для стимуляции синтеза стероидных гормонов в коре надпочечников. В клетках промежуточной доли гипофиза АКТГ расщепляется с образованием α-меланоцитстимулирующего гормона (α-МСГ).

3.6.3. Убиквитин-зависимая система протеолиза в регулируемой деградации белков

Убиквитин-зависимая система протеолиза проводит поиск потенциальной мишени для протеолитической деградации среди огромного числа внутриклеточных белков. Все белки несут в себе специфические сигналы деградации по аналогии с сигнальными последовательностями, которые направляют вновь синтезируемые белки к определенным органеллам или микрокомпартментам клетки. Однако сигналы протеолитической деградации должны быть более сложными и разнообразными, так как с их помощью не только маркируются белки, удаляемые с помощью протеолиза, но и определяется время удаления, а также скорость их протеолитического расщепления. Для распознавания и декодирования таких сигналов в клетках эукариот имеется убиквитин-конъюгирующая система.

Как в ядре, так и в цитоплазме эта система отделена пространственно и функционально от протеолитических ферментов, организованных в протеасомы. Распознанные данной системой белки-субстраты маркируются путем ковалентного присоединения к ним молекул небольшого стабильного 76звенного белка – убиквитина. В результате убиквитин соединяется C-концом с боковыми остатками лизина в субстрате. Наличие такой метки в белке, повидимому, является первичным сигналом сортировки, направляющей образовавшиеся конъюгаты к протеасомам. В большинстве случаев к субстрату присоединяется несколько молекул убиквитина, которые организованы в виде

378

бусинок на нитке. Молекулы белков, содержащие убиквитин, по-видимому, являются для протеасом предпочтительными субстратами. Конъюгацию убиквитина с субстратом можно представить следующим образом (рис. I.41). Вначале убиквитин-активирующий фермент (E1) связывает убиквитин, гидролизует ATP и образует тиоэфирную связь между AMP и убиквитином с последующим переносом молекулы убиквитина на один из своих остатков Cys. Молекула активированного убиквитина далее соединяется с одним из ферментов семейства убиквитин-конъюгирующих ферментов (E2) и часто вслед за этим с убиквитин-лигазой (E3). Процесс конъюгации убиквитина с субстратом может катализироваться как самим E2, так и E2 совместно с E3. Белки E2 и E3 в клетках существуют в виде больших семейств, члены которых различаются по свойствам и внутриклеточной локализации. Мутации в генах семейства E2 у дрожжей показывают, что в ДНК-репарацию, прохождение клеточного цикла, биогенез пероксисом, а также в обеспечение устойчивости к тепловому шоку и ионам кадмия вовлечены разнообразные ферменты. Некоторые из ферментов E2 способны образовывать между собой гетеродимеры, которые, вероятно, в сочетании с различными белками E3 обеспечивают весь большой репертуар субстратных специфичностей убиквитин-конъюгирующих комплексов.

Рис. I.41. Этапы функционирования убиквитинзависимой системы протеолиза

Е1–Е3 – ферменты, активирующие убиквитин с функционально-активными SH-группами, PPi – неорганический пирофосфат

379

Структура и функционирование протеасомы. Белки, меченные цепями убиквитина, после взаимодействия с протеасомами расщепляются до коротких пептидов и свободных аминокислот в результате ATP-зависимой реакции. У эукариот протеасомы присутствуют в цитозоле и ядрах, но не в других клеточных органеллах. Протеасомы выделяют в виде индивидуальных частиц с коэффициентами седиментации 20S и 26S. 20S частица является коровой частью 26S частицы, которая обладает протеолитической активностью. Коровая частица представляет собой белковый комплекс в виде цилиндра, через центральный канал которого "протягивается" молекула гидролизуемого белка. В настоящее время в качестве модельного объекта часто используют протеасомы архебактерии Thermoplasma, которые были закристаллизованы и исследованы с помощью рентгеноструктурного анализа.

Установлено, что протеасома Thermoplasma построена из двух (α и β) субъединиц. Кольцевые структуры на обоих концах цилиндра протеасомы составлены из α-, а центральная часть – из β-субъединиц в отношении α7β7β7α7

(рис. I.42). Протеолитическая активность присуща β-субъединицам, причем их активные центры направлены внутрь полости цилиндра протеасомы. Кроме того, кольца α-субъединицы по обоим концам молекулы образуют узкие отверстия диаметром 13 Å, через которые может пройти только развернутая цепь полипептида. Это механистически объясняет, каким образом протеасома избирательно расщепляет полипептидные цепи белков, меченные убиквитином. Прежде чем войти в контакт с активными центрами протеиназ, полипептидная цепь деградируемого белка должна быть развернута. Пептиды и аминокислоты, образующиеся в центральной части цилиндра протеасомы, покидают ее через переднее или заднее отверстия, сформированные α- субъединицами. Протеасомы Thermoplasma лишены специфичности в отношении деградируемых белков, и их функционирование требует наличия в N-концевой части β-полипептидов остатка Thr. Интересно, что остатки Thr

эукариотических β-субъединиц являются мишенью для антибиотика лактацистина из Streptomyces, который ковалентно связывается с этими остатками, необратимо инактивируя протеасомы.

380

Рис. I.42. Гипотетическая схема функционирования протеасомы убиквитинзависимой системы протеолиза

Молекулы убиквитина присоединяются к деградируемой полипептидной цепи (1,2) и конъюгат далее взаимодействует с 26S протеасомой (3). Узкий цилиндр изображает кόровую 20S субчастицу протеасомы, обладающую протеолитической активностью. Полипептидная цепь, разворачиваясь, входит в центральную полость 20S субчастицы, где последовательно подвергается протеолизу (4, 5). При этом цепи убиквитина отделяются от деградируемого белка

Локализация активных центров β-субъединиц внутри протеасомы затрудняет неконтролируемую деградацию окружающих белков. Отдельные субъединицы до включения их в состав зрелых протеасом синтезируются в виде неактивных предшественников, что предотвращает их преждевременное протеолитическое действие и является общим принципом биосинтеза протеолитических ферментов. Подобно тому как ферменты лизосом активируются только после их перемещения в соответствующий компартмент клетки, процессинг β-предшественников сопряжен с их включением в состав протеасом. Сборка протеасом начинается с образования гептамерных α-

субчастиц (α7), которые стимулируют аутокаталитическое удаление пропоследовательности предшественника β-субъединиц, что приводит к их упорядоченной самосборке с образованием гептамерных β-субчастиц (β7),

состыкованных с α-субчастицами. Две предварительно собранные половины протеасомы (α7β7) далее ассоциируют друг с другом с образованием активных

Распознавание конъюгатов убиквитина и разворачивание белковой глобулы происходят с участием 16 белков, ассоциированных с 20S протеасомой и образующих 26S комплекс. Эти белки способны объединяться в отдельные