2.2. Мейотический тест и его использование в цитогенетическом мониторинге

Ввиду большой чувствительности к внешним воздействиям, мейоз представляет собой удобную систему для генетического мониторинга (Бондарь Л.М., Частоколенко Л.В., 1990). Анализ мейоза может дать наиболее полную информацию о генетических последствиях тех или иных воздействий на растения. Клетки спорогенной ткани дифференцируются на ранних стадиях онтогенеза и развиваются в течение всего жизненного цикла растения. Большие размеры ядра и хромосом в профазе мейоза и большая продолжительность мейоза по сравнению с митозом, что делает ядро в стадии мейоза более чувствительным к антропогенной нагрузке (Бондарь Л.М., Попова О.Н., 1989). Кроме повышения уровня аномалий в мейозе, увеличивается частота полностью стерильных растений. Отмечено уменьшение числа археспориальных клеток в пыльниках, дегенеративное изменение пыльцы (Бондарь Л.М., Частоколенко Л.В. и др., 1991).

2.2.1.Влияние ионизирующего излучения на частоту хромосомных аберраций в мейозе

Чувствительность клеток к излучению может быть разной в связи с различным физическим состоянием молекул в протоплазме. Это обстоятельство имеет большое значение, так как в различные периоды жизнедеятельности клетки физические свойства ее макромолекул и структур меняются ( Константинов А.В., 1971 ).

Опыты по использованию микропучков для облучения отдельных структур и участков клетки показали, что наиболее губительно излучение действует на ядро и хромосомы. В облученных клетках происходят обратимые и необратимые изменения: пикноз ядра, склеивание хромосом, фрагментация хромосом, образование гигантских ядер и многоядерных клеток, нарушение полярности делений, возникновение ядер с различным числом хромосом. Частота и характер хромосомных аберраций зависит от дозы облучения и от того, в какой период митотического и мейотического циклов было произведено облучение (Зайнуллин В.Г., 1998; Константинов А.В., 1971). Воздействие возможно в двух состояниях хромосом: 1) на недуплицированные хромосомы (интерфаза, период G1); 2) на дуплицированные хромосомы (профаза, метафаза, период G2 ).

Облучая микроспоры традесканции рентгеновскими лучами, Сакс (Сакс А., 1938,1941, цит по Делоне Н.Л., 1960 ) установил, что при этом возникают простые терминальные делеции и изохроматидные аберрации, частота которых линейно возрастала с увеличением дозы. Выход таких аберраций не зависел от фактора времени. Результаты этих опытов позволили Саксу заключить, что разрывы хромосом, происходящие при облучении, не зависят друг от друга, и частота их прямопропорциональна дозе облучения. Предполагалось, что часть разрывов может остаться невоссоединенной и явиться причиной делеций. Большая же их часть воссоединяется, восстанавливая исходную структуру, а при неправильном слиянии приводит к обмену фрагментами. Обычно в обмене участвуют те разрывы, которые находятся в непосредственной близости друг от друга (Делоне Н.Л., 1960).

Сейчас есть данные о том, что цепи ДНК в процессе репликации подвергаются разрывам. Если эти разрывы заживляются при участии ферментов, осуществляющих пострепликативное восстановление после облучения или последние этапы восстановления по механизму выщепления ресинтеза, то мутации чувствительности к ионизирующим излучениям должны вести к увеличению спонтанной летальности или спонтанной мутабельности ( Захаров И.А., 1970 ).

Ли и Кетчсайд в 1942 году показали, что разрывы под действием радиации образуются в результате нескольких актов ионизации, происходящих внутри хромосомной нити или около нее. Существование двух независимых эффектов радиации ( разрыв и соединения ) было хорошо доказано на разных объектах. Например, разрывы хромосом микроспор традесканции остаются способными к соединению в течение 20-30 минут после облучения ( Вольф В.Г., 1958 ).

По классической теории образования аберраций (Сакс, 1938-1941) радиация вызывает множество разрывов хромосом, значительная часть которых соединяется. Большинство оставшихся разрывов вовлекается в обмен, а остальные проявляются в метафазе. Таким образом, разрывы хромосом и хроматид рассматриваются как последствия первичного радиобиологического эффекта, который реализуется в ходе интерфазы (Захаров И.А., 1970).

Предполагается, что хромосомный тип аберраций возникает при действии облучения до репликации хромосом, а хроматидный - при облучении реплицированных хромосом. Многими исследователями доказано, что период S разделяет время образования хромосомных и хроматидных аберраций. Иначе говоря, облучения в пресинтетический период вызывает аберрации хромосомного типа, а в постсинтетический - хроматидного типа. С наступлением синтетического периода частота хромосомных разрывов резко снижается, а хроматидных - возрастает ( Битти А.В., 1960; Ривелл Л., 1960 ).

Единственным точным методом оценки действия радиации на живые клетки является прижизненное наблюдение облученных клеток. В данном случае можно непосредственно установить контроль за определенной клеткой сразу после облучения и без малейших погрешностей определить фазу на которой она была облучена. В тех случаях, когда непосредственного наблюдения за облученными клетками установить нельзя, прибегают к фиксации материала через определенное время после облучения. Поскольку учет перестроек хромосом можно производить только в метафазе, анафазе и ранней телофазе, то зная время в момент облучения и в момент фиксации, а также продолжительность каждой фазы, можно высчитать, в какой фазе была облучена клетка ( Делоне Н.Л., 1960 ). Нужно знать, сколько времени продолжается каждая фаза в цикле клеточного деления каждого растения. Например, для лука репчатого при 20 °С интерфаза продолжается 20 - 26 часов, от ранней профазы до анафазы проходит два часа, анафаза и телофаза вместе длятся около 45 минут, весь цикл деления клетки продолжается 23 - 29 часов ( Kihlman B., 1955 ). В другом литературном источнике указаны иные данные: общая длительность митотического цикла у Allium cepa составляет 13-15 часов при температуре 24-25 °С (Гриф В. Г., Иванов В.Б., 1975).

Зная длительность промежутка времени от момента облучения до фиксации и наблюдая состояние клетки после фиксации можно определить, в какой фазе находилось ядро клетки во время облучения.

Пыльник обычно содержит до 1000 клеток, пригодных для наблюдения. Поскольку различные бутоны в одном соцветии содержат микроспоры в последовательных фазах развития, то при одной экспозиции можно обработать клетки на различных стадиях

( Делоне Н.Л., 1960 ).