2. Место цитогенетического мониторинга в системе исследования загрязнения окружающей среды. Методы цитогенетического мониторинга

В состав генетического мониторинга входит цитогенетический мониторинг, задачей которого является регистрация возникающих под действием антропогенных факторов изменений в структуре генофонда и прогнозирование темпов ее перестройки (Бурдин К.С., 1985; Дмитриева С.А., Парфенов В.И., 1991). Но цитогенетический мониторинг может быть использован не только как составляющая часть генетического мониторинга. В экологическом мониторинге он дополняет генетические данные и результаты исследований по воздействию загрязнителей и позволяет решить две задачи: составить полную картину при экспертизе биологических последствий загрязнения, оценить роль антропогенных воздействий на стабильность сортов растений, от которых зависит их продуктивность (Ваулина Э.Н. и др., 1977; Турков В.Д. и др.,1990; Глотов Н.В.и др., 1995).

Мутационный груз, возникающий в растительных популяциях в результате влияния антропогенной нагрузки, можно сравнительно быстро определить с помощью современных цитогенетических методов, используя один из основных цитогенетических критериев - частоту клеток с перестройками хромосом в первых митозах меристемы корней. Это позволяет установить различия между популяциями из загрязненных и контрольных районов (Шумный В.К. и др., 1993).

Учет аберраций хромосом можно проводить на стадии метафазы (метафазный метод) или на стадии поздней анафазы и ранней телофазы (ана-телофазный метод). Оба метода имеют как преимущества, так и недостатки.

Метафазный метод более точен. Он дает возможность выявить в 1,5 раза больше мутаций и позволяет учесть с предельной точностью все типы хромосомных и хроматидных перестроек, а также геномные мутации. Вместе с тем он является достаточно трудоемким и связан с определенными ограничениями в выборе объектов для исследований. Так, наиболее результативен он при использовании видов с небольшим числом крупных, хорошо идентифицируемых хромосом. Создаются затруднения при изготовлении давленых препаратов высокого качества (Шарма А., 1989; Sharma A., 1985).

При использовании ана-телофазного метода для анализа пригодна почти каждая делящаяся клетка. Этот метод менее точен. Он позволяет учесть лишь некоторые типы хромосомных аберраций. Его принято считать экспресс-методом для предварительной оценки активности тех или иных агентов. Тем не менее, ана-телофазный метод широко применяется для выявления мутагенных эффектов (Дмитриева С.А., Парфенов В.И., 1991; Holub Z. et al., 1986).

2.1. Учет хромосомных аберраций в митозе и механизмы их образования

В основе структурных перестроек лежит свойственная всем хромосомам способность при определенных условиях разрываться на части, фрагментироваться (Лучник Н.В., 1968; Шевченко В.В., 1969; Турков В.Д. и др., 1990). Происхождение и судьба разных типов аберраций хромосом неодинакова. Одним из наиболее важных факторов принято считать установление зависимости между митотическим циклом и реакцией хромосом на действие антропогенной нагрузки. В результате антропогенного воздействия на хромосомы на разных стадиях ядерного цикла образуются разные типы перестроек, которые обусловлены, в основном, самой структурой хромосом в каждой данной стадии. В стадии G1 хромосома ведет себя как отдельная нить. Возникают межхромосомные обмены, кольца, хромосомные делеции и сложные хромосомные перестройки. В стадию S хромосома обнаруживает двойственную структуру, субнити которой ведут себя самостоятельно, образуя полухроматидные концевые делеции, полухроматидные межхромосомные обмены (транслокации), полухроматидные интерстициальные делеции (микрофрагменты), изо- полухроматидные делеции, а также полухроматидно-изополухроматидные трирадиалы.

В стадию G2 образуются хроматидные перестройки: концевые делеции, изосестринские делеции, симметричные и ассиметричные межхромосомные хроматидные обмены, трирадиалы (Ивенс Х., 1966; Соколов Н.Н., Сидоров Б.Н.,1969).

При повреждении двухроматидной хромосомы образуется ацентрический фрагмент и укороченная хромосома. Если при соединении разорванных концов исходная структура восстанавливается, то никаких перестроек не происходит. При двух близких одновременных разрывах случайное соединение четырех свободных концов обуславливает различные аберрации обменного типа. В анафазе - телофазе митоза фрагмент обнаруживается между полюсами. Судьба фрагментов ( одиночных и множественных) различна. Они могут попасть в одно из дочерних ядер, резорбироваться или образовывать дополнительное микроядро ( Мекшенков М.И., 1962; Бостон К., Самнер Э., 1981).

Мост является следствием фрагментации двух хромосом. При воссоединении фрагментов, содержащих центромеры, образуется дицентрическая хромосома, которая испытывает воздействие обоих митотических центров, и, растягиваясь между дочерними группами анафазных-телофазных хромосом, образует мост. Аналогично на стадии G2 и S образуется хроматидный мост (Белецкий Ю.Д. и др., 1966; Корытова А.И., Михайлов О.Ф., Яцук Н.А., 1985).

Отставания хромосом в метакинезе и при расхождении к полюсам возникают при повреждении хромосомы в области кинетохора. Или это может быть связано с действием антропогенных веществ на мембраны митохондрий так, что из этих органелл в цитоплазму выходит кальций. Повышения уровня кальция может подавлять формирование белковых микротрубочек, а следовательно, и образования митотического веретена. Окончательным итогом будет нерасхождение хромосом в митозе. Отставшие хромосомы либо разрушаются и элиминируют из клетки, либо формируют дополнительное микроядро (Алов И.А., 1972; Дубинин Н.П. и др., 1980; Яблоков А.В. А.В.Остроумов С.А., 1985).

Перестройки хромосом (хромосомные аберрации, хромосомные мутации) подразделяют на два основных типа: симметричные и асимметричные. Первый тип связан с образованием в результате перестройки отдельных хромосом с одной центромерой, второй - с появлением ацентрических и дицентрических фрагментов.

При анализе перестроек в анафазе учитываются лишь асимметричные перестройки: фрагменты, кольца ( замкнувшиеся фрагменты, образовавшиеся в результате двух разрывов), хромосомные и хроматидные мосты. Мосты могут быть образованы дицентрическими хромосомами, возникающими либо в результате транслокаций, либо изохроматидных делеций. Могут возникать мосты также из дицентрических колец (Мекшенков М.И., 1962).