laboratornye_raboty / №10 Спектрофотометрический анализ вещества

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования

"ВОРОНЕЖСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ им. Н.Н. БУРДЕНКО"

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

КАФЕДРА МЕДИЦИНСКОЙ ФИЗИКИ

Методические указания студентам по теме лабораторного занятия

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ВЕЩЕСТВА

Воронеж 2009

РАЗДЕЛ: ФИЗИКА АТОМОВ И МОЛЕКУЛ. ЭЛЕМЕНТЫ КВАНТОВОЙ БИОФИЗИКИ.

ТЕМА: Спектрофотометрический анализ вещества.

ЦЕЛЬ: Изучить законы поглощения света веществом; обозначить область применения фотоколо-

риметрии в биологии, медицине, фармации; сформировать у студентов навыки проведения качественного анализа веществ с помощью фотоэлектроколориметра. После проведения лабораторного занятия студенты должен знать природу и основные характеристики оптиче-

ского излучения, закономерности поглощения света веществом; иметь понятие об оптиче-

ской плотности, светопропускании, светопоглощении.

ПРАКТИЧЕСКИЕ НАВЫКИ: В ходе выполнения работы студенты должны приобрести навыки практической работы с фотоэлектроколориметром, уметь проводить качественный анализ веществ, применять спектральные методы анализа веществ.

МОТИВАЦИЯ ТЕМЫ: Свойство атомов и молекул поглощать свет определенных длин волн, ха-

рактерных для данного вещества, широко используется в медицине и фармации для прове-

дения качественных и количественных исследований. Измерение спектров поглощения по-

зволяет судить о химическом составе вещества и его состоянии в биологических структу-

рах. Для регистрации спектров поглощения в ультрафиолетовой и видимой области исполь-

зуют приборы спектрофотометры, только в видимой области – фотоэлектроколориметры.

I. САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ ВО ВНЕУРОЧНОЕ ВРЕМЯ.

Задание 0.

Повторение материала школьного курса физики, раздел "Оптика", тема "Шкала электромагнитных волн".

Задание 1.

Изучить теоретический материал занятия, используя рекомендованную литературу и настоящую разработку, по следующей логической структуре учебного материала:

1. Природа света:

а) понятие о световой волне;

б) спектральные области оптического излучения. 2. Поглощение света веществом:

а) понятие о поглощении света веществом;

б) законы, описывающие взаимодействие света с веществом;

в) следствие из закона Бугера-Ламберта-Бера, описывающее связь между величиной оптиче-

ской плотности и концентрацией вещества.

2

3.Характеристики поглощающей способности вещества:

а) оптическая плотность;

б) светопропускание;

в) светопоглощение;

г) связь между оптической плотностью и коэффициентом пропускания света;

д) понятие и физический смысл коэффициента молярной экстинкции (поглощения) вещества.

4.Спектр поглощения биологических веществ:

а) определение спектра поглощения вещества;

б) понятие о хромофорах;

в) хромофоры в биологических молекулах (белки, нуклеиновые кислоты). 5. Абсорбционная фотоэлектроколориметрия:

а) назначение, принцип действия, устройство фотометра КФК-3;

б) оптическая схема фотоэлектроколориметра;

в) применение абсорбционной фотоэлектроколориметрии в медицине и фармации.

Средства для самоподготовки студентов во внеурочное время

1.Учебная и методическая литература а) основная

– Ремизов А.Н. Медицинская и биологическая физика / А.Н. Ремизов, А.Г. Максина, А.Я.

Потапенко. – М.: Дрофа, 2004. – С. 280-282, 446-450.

– Федорова В.Н. Медицинская и биологическая физика / В.Н. Федорова, Е.В. Фаустов. – М.:

ГЭОТАР-Медиа, 2008. – С. 302-310, 468-479.

– Антонов В.Ф. Физика и биофизика. Практикум /В.Ф. Антонов, А.М. Черныш, Е.К. Козлова,

А.В. Коржуев. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2008. – С. 96-116.

– Блохина М.Е. Руководство к лабораторным работам по медицинской и биологической фи-

зике / М.Е. Блохина, И.А. Эссаулова, Г.В. Мансурова. – М.: Дрофа, 2002. – С. 237-246.

– Лекционный материал по разделу " Квантовая биофизика".

б) дополнительная

–Артюхов В.Г. Биофизика / В.Г. Артюхов, Т.А. Ковалева, В.П. Шмелев. – Воронеж: Изд-во Воронеж. ун-та, 1994. – С. 229-234.

–Артюхов В.Г. Практикум по биофизике / В.Г. Арюхов и др. – Воронеж: ВГУ, 2001. – С. 5157.

–Артюхов В.Г. Оптические методы анализа интактных и модифицированных биологических систем / В.Г. Артюхов, О.В. Путинцева. – Воронеж: Изд-во Воронеж. ун-та, 1996. – С. 61171.

2.Консультации преподавателей (еженедельно по индивидуальному графику).

3

ТЕОРЕТИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ ПО ТЕМЕ ЗАНЯТИЯ

Свет или оптическое излучение представляет собой волны электромагнитного поля. Свето-

вые волны являются плоскопоперечными, они распространяются перпендикулярно направлению электрического и магнитного полей.

Различают следующие спектральные области оптического излучения: инфракрасная (ИК) –

от 750 до 2500 нм, видимая – от 400 до 750 нм и ультрафиолетовая (УФ) – от 2 до 400 нм.

Известно, что при пропускании света через слой вещества его интенсивность уменьшается.

Уменьшение интенсивности является следствием взаимодействия световой волны с электронами вещества, в результате которого часть световой энергии передается электронам. Это явление на-

зывается поглощением света.

Взаимодействие света с веществом описывается рядом законов, основными из которых яв-

ляются:

1. Закон Гротгуса-Дрейпера: химически активным является излучение с такими длинами волн,

которые поглощаются веществом. Этот закон не имеет исключений.

2.Закон Вант-Гоффа: количество химически модифицированного светом вещества прямо пропорционально количеству поглощенной веществом энергии света.

3.Закон Бугера-Ламберта-Бера (объединенный закон светопоглощения) для монохроматиче-

ского света: интенсивность света, прошедшего через слой вещества (I), и интенсивность света,

падающего на него (I0), связаны соотношением:

I I0e ε cl,

где – молярный коэффициент поглощения (экстинкции) при длине волны (л/моль∙см); с –

концентрация вещества (моль/л); l – длина оптического пути – толщина слоя вещества (см).

Молярный коэффициент экстинкции характеризует способность молекул вещества погло-

щать свет определенной длины волны и определяется структурными особенностями молекул дан-

ного вещества.

Объединенный (основной) закон светопоглощения базируется на законе Бугера-Ламберта

(первый закон светопоглощения), который определяет ослабление интенсивности светового пото-

ка в зависимости от толщины поглощающего слоя, и законе Бера (второй закон светопоглощения),

описывающем зависимость светопоглощения от концентрации анализируемого раствора. Закон Бугера-Ламберта-Бера выполняется не всегда. Он выведен для достаточно разбавленных раство-

ров при использовании монохроматического света.

Для характеристики поглощающей способности вещества используют такие величины, как оптическая плотность, светопропускание и светопоглощение.

Оптическая плотность (D) – это десятичный логарифм отношения интенсивности света,

4

падающего на образец, к интенсивности света, выходящего из образца (I):

D lgI0

I .

Оптическая плотность является безразмерной величиной.

Светопропускание (коэффициент пропускания) ( ) – отношение интенсивности света, вы-

шедшего из образца, к интенсивности света, падающего на него:

τ I I0 .

Значения могут меняться от 0 (весь свет поглощается) до 1 (весь свет проходит). Величи-

ну обычно выражают в процентах.

Иногда вместо используют светопоглощение (коэффициент поглощения) – величина,

равная 1-

1 τ I0 I Iп , I0 I0

где Iп – интенсивность поглощенного света. Светопоглощение принято измерять в долях или в процентах.

Важнейшим следствием из закона Бугера-Ламберта-Бера является следующее положение:

оптическая плотность прямо пропорциональна концентрации данного вещества:

D ε cl.

Спектр поглощения – это зависимость молярного коэффициента поглощения от длины волны . Спектры поглощения веществ определяются разностью энергий между энергетическими уровнями молекул, составляющими вещество, а также вероятностями перехода между ними. Раз-

ность энергий определяет длину волны, на которой происходит поглощение света, вероятность перехода – коэффициент поглощения вещества. Для биологически важных молекул характерны широкие полосы поглощения, обусловленные электронными, колебательными и вращательными уровнями.

Поглощение света осуществляется не всей молекулой, а определенными ее участками.

Хромофоры – это отдельные группы атомов в молекуле вещества, поглощающие кванты света в УФ- и видимой областях спектра. В нуклеиновых кислотах хромофорами являются пуриновые и пиримидиновые азотистые основания (аденин, гуанин, тимин, цитозин, урацил), поглощающие в УФ-области (180-220 и 240-280 нм).

Белки имеют три типа хромофорных групп: собственно пептидные группы, боковые груп-

пы аминокислотных остатков и простетические группы. Первые два типа хромофоров поглощают только в УФ-области. Пептидные группы –CO-NH– поглощают в области 190 нм. Боковые группы трех ароматических аминокислот – триптофана, тирозина и фенилаланина – также поглощают на

5

этих длинах волн, причем значительно сильнее, чем пептидные группы. Кроме того, они имеют

Поэтому с помощью спектров поглощения можно измерить содержание кислорода в крови человека.

Спектры поглощения можно регистрировать различными приборами. В видимом диапазоне

(380-760 нм) спектр поглощения определяет цвет вещества, поэтому прибор для измерения спек-

тров называется колориметром (от лат. сolor – цвет). Современные колориметры позволяют про-

водить измерения в более широком спектральном диапазоне от ультрафиолета до ближнего ин-

фракрасного (315–980 нм).

Применение фотоэлектроколориметрии в биологии, медицине и фармации:

1.Измерение концентрации окрашенных веществ (некоторых витаминов, лекарств) в растворе.

2.Определение рН среды по цвету добавленных в раствор рН–индикаторов.

3.Определение активности ферментов по интенсивности окрашивания раствора после добавления соответствующих химических реагентов, дающих окрашенные реакции с продуктами фермента-

тивной реакции (например, оценка активности АТФ-аз по скорости образования неорганического фосфата).

4. Оценка скорости роста микроорганизмов по увеличению оптической плотности культуральной жидкости вследствие рассеяния света на микроорганизмах.

Фотометр фотоэлектрический КФК-3

Назначение

Фотометр КФК-3 предназначен для измерения коэффициента пропускания и оптической

6

плотности прозрачных жидкостей и твердых образцов, а также для наблюдения за изменением оп-

тической плотности исследуемых образцов во времени и определения концентрации вещества в растворе после предварительной градуировки (калибровки) фотометра.

Принцип действия

Принцип действия фотометра КФК-3 основан на сравнении потока излучения Ф0, прошед-

шего через «холостую пробу» (растворитель или контрольный раствор, по отношению к которому производится измерение) и потока излучения Ф, прошедшего через исследуемый раствор.

Потоки излучения I0 и I фотоприемником преобразуются в электрические сигналы U0, U и Uт (Uт – сигнал при неосвещенном фотоприемнике), которые обрабатываются встроенной микро-

ЭВМ и представляются на индикаторе в виде коэффициента пропускания, оптической плотности,

скорости изменения оптической плотности, концентрации.

С помощью микроЭВМ рассчитывается коэффициент светопропускания исследуемого раствора по формуле:

Оптическая плотность D исследуемого раствора рассчитывается по формуле:

Внешний вид и устройство фотометра

Фотометр выполнен в виде одного блока (рис. 2). На металлическом основании (1) закреп-

лены отдельные узлы, которые закрываются кожухом (2). Кюветное отделение закрывается съем-

ной крышкой (3). В кюветном отделении в кюветодержателе, устанавливаемом на подвижный столик, располагают кюветы. Кюветодержатель располагают так, чтобы две маленькие пружины находились с передней стороны. Ввод в световой пучок одной или другой кюветы осуществляется перемещением ручки (4) до упора влево или вправо. При установке ручки до упора вправо – в све-

товой пучок вводится кювета с исследуемым раствором. При открытой крышке кюветного отде-

ления специальная шторка автоматически перекрывает световой пучок, чтобы не засвечивать фо-

топриемник. Дело в том, что фотоприемник даже в отсутствии освещения дает на выходе так на-

зываемый "темновой" сигнал, свойства которого меняются после изменения освещенности и ис-

кажают результаты измерений. Поэтому при открытом кюветном отделении световой пучок пере-

крывают, а после закрытия крышки необходимо подождать некоторое время, прежде чем произво-

дить измерения. Ручка (5) служит для поворота дифракционной решетки и установки требуемой длины волны. В фотометр типа КФК-3 входят фотометрический блок, блок питания и микропро-

цессорная система.

7

#– многофункциональная:

–градуировка фотометра по "холостой" пробе;

–перевод МПС в режим измерений оптический плотностей стандартных растворов.

Оптическая схема прибора

Нить лампы (1) (рис. 3) изображается конденсором (2) в плоскости диафрагмы (D1), запол-

няя светом щель диафрагмы. Далее диафрагма (D1) изображается вогнутой дифракционной решет-

кой (4) и вогнутым зеркалом (5) в плоскости такой же щелевой диафрагмы (D2). Дифракционная решетка и зеркало (5) создают в плоскости диафрагмы (D2) растянутую картину спектра. Вращая дифракционную решетку вокруг оси, параллельной штрихам решетки, выделяют щелью диафраг-

мы (D2) излучение любой длины волны – от 315 до 990 нм. Через поворотное зеркало (6) световой пучок попадает на объектив (7, 8), который создает в кюветном отделении слабо сходящийся пу-

чок света и формирует увеличенное изображение щели (D2) перед линзой (10), которая сводит пу-

чок света на приемнике (11) в виде равномерно освещенного светового кружка. Для уменьшения влияния рассеянного света в ультрафиолетовой области спектра за диафрагмой (D1) установлен светофильтр (3), который работает в схеме при измерениях в спектральной области 315–400 нм, а

затем автоматически выводится.

В кюветное отделение (между объективом (7, 8) и линзой (10)) устанавливаются прямо-

угольные кюветы (9).

Рис. 3. Оптическая (принципиальная) схема фотометра КФК-3 (обозначения в тексте).

9

II. РАБОТА СТУДЕНТОВ ВО ВРЕМЯ ПРАКТИЧЕСКОГО ЗАНЯТИЯ.

Задание 1.

Получить допуск к занятию. Для этого необходимо:

– иметь конспект в рабочей тетради, содержащий название работы, основные теоретические понятия изучаемой темы, задачи эксперимента, таблицу по образцу для внесения эксперимен-

тальных результатов;

–успешно пройти контроль по методике проведения эксперимента;

–получить у преподавателя разрешение выполнять экспериментальную часть работы.

Задание 2.

Зарегистрировать спектр поглощения раствора аммиаката меди (комплексное соединение ионов меди с аммиаком, обладающее интенсивной сине-голубой окраской).

Приборы и принадлежности

1.Фотоэлектроколориметр КФК-3.

2.Кюветы.

3.Раствор аммиаката меди.

4.Бумажные или марлевые салфетки.

Выполнение работы

1. Подготовка фотометра к работе:

1.1. Проверить подсоединение прибора к сети переменного тока (при этом тумблер "СЕТЬ"

должен быть в выключенном положении, крышка кюветного отделения – закрыта).

1.2.Включить прибор (тумблер "СЕТЬ").

1.3.Отвести на прогрев прибора 10-30 минут. Подготовка фотометра к работе осуществляется в автоматическом режиме:

на индикаторе отображается символ завода-изготовителя "ОАО "ЗОМЗ", сообщение "ПРО-

ГРЕВ ПРИБОРА" и показания времени (обратный отсчет);

по истечении 1 минуты на индикаторе отображается надпись "Автоградуировка", при этом автоматически учитывается «нулевой отсчет», включается источник излучения; на инди-

каторе отображается значение длины волны в " = ХХХ.Х nm" и показания таймера;

по истечении 10 минут фотометр выдает звуковой сигнал готовности к работе и на индика-

торе отображается надпись "ГОТОВ К РАБОТЕ. ВВЕДИТЕ РЕЖИМ". Фотометр готов к работе.

2.Измерение оптической плотности исследуемого раствора аммиаката меди в диапазоне длин

10