Микроб билеты / Билет 13

Билет 13

1. Клеточная стенка. Это внешняя структура бактерий толщиной 10–35 нм, отделенная от цитоплазматической мембраны очень узким ободком периплазматического пространства. Она несет в основном формообразующую и защитную функции.

Главным компонентом клеточной стенки бактерий является особый, только им присущий гетерополимер, который называется пептидогликаном. Это вещество состоит из параллельно чередующихся полисахаридных (гликановых) цепей, поперечно скрепленных пептидными связями. Пептидогликан придает клеточной стенке бактерий большую прочность и защищает их от действия осмотического давления, которое может достигать внутри клетки 20–25 атм.

При действии лизоцима, пенициллина и некоторых других веществ, разрушающих пептидогликан или нарушающих его синтез, бактерии вначале превращаются в сферопласты, а далее, полностью утратив клеточную стенку, – в бесформенные протопласты, быстро подвергающиеся плазмолизу. Дефектные по клеточной стенке бактерии, которые образуются в организме, обладают жизнеспособностью и патогенностью, называют L–формами в честь института Листера, где они были открыты.

Количественное содержание пептидогликана определяет характер окраски бактерий и других прокариот по Граму. Те из них, которые содержат в клеточной стенке большое его количество (около 90 % пептидогликана), окрашиваются по Граму в сине–фиолетовый цвет и их называют грамположительными, все другие, содержащие в оболочке 5–20 % пептидогликана, – в розовый цвет и их называют грамотрицательными. Толщина слоя пептидогликана в клеточной стенке грамположительных бактерий в несколько раз больше, чем у грамотрицательных.

Помимо пептидогликана, в клеточной стенке грамположительных бактерий содержатся тейхоевые кислоты, полисахариды и белки. Грамотрицательные бактерии покрыты наружной мембраной, в состав которой входят липополисахариды и базальные белки.

Для окраски по Граму необходимо подготовить: 1) феноловый раствор генцианового фиолетового (генцианвиолет – 1 г, этанол 96 % – 10 мл, фенол кристаллический – 2 г, вода дистиллированная – 100 мл); 2) раствор Люголя – концентрированный раствор калия иодида (2 г), в котором растворяют кристаллический йод (1 г), а затем прибавляют дистиллированную воду (300 мл); 3) этанол 96 %; 4) водный фуксин Пфейффера.

Техника окраски по Граму. 1. Фиксированный мазок 1–2 мин окрашивают раствором генцианвиолета (по методу Синева его покрывают пропитанной тем же красителем полоской фильтровальной бумаги, которую смачивают 2–3 каплями воды). 2. Слив генцианвиолет (сняв полоску бумаги Синева), мазок 1 мин обрабатывают раствором Люголя и, не промывая водой, сливают его. 3. Обесцвечивают спиртом в течение 0,5 мин, промывают водой. 4. Окрашивают 1–2 мин фуксином Пфейффера. 5. Мазок ополаскивают водой и высушивают.

11. L-формы бактерий. Морфология микоплазм и других молликут.

При действии лизоцима, пенициллина и некоторых других веществ, разрушающих пептидогликан или нарушающих его синтез, бактерии вначале превращаются в сферопласты, а далее, полностью утратив клеточную стенку, – в бесформенные протопласты, быстро подвергающиеся плазмолизу.

Дефектные по клеточной стенке бактерии, которые образуются в организме, обладают жизнеспособностью и патогенностью, называют L–формами в честь института Листера, где они были открыты.

Также морг может лишаться клет. стенки в результате длительного культ-ния на пит. средах в лабораториях.

Микоплазмы (сем Mycoplasmacea, класс Mollicutes) не способны синтезировать компоненты клеточной стенки. Вместо неё микоплазмы покрыты трехслойной эластичной мембраной, состоящей из липопротеиновых соединений, фосфолипидов с включением стеринов, которых нет у бактерий и риккетсий. Содержат большое количество белка и нуклеиновых кислот; количество углеводов варьирует.

Морфология и способы размножения. Большинство из них – факультативные анаэробы. Так как микоплазмы не имеют ригидной оболочки, они очень полиморфны. В мазках из культур обнаруживаются различные микроструктуры: гранулы, в виде крошечных кокков и элементарных телец; крупные шары; кольца; палочки, нити и ветвящиеся мицелиальные формы; аморфные массы, меняющиеся в конфигурации. Размеры микоплазм варьируют от 125–250 нм у мелких гранулярных форм до 0,4 –150 мкм у нитевидных структур. Микоплазмы не образуют жгутиков, капсул и спор. По Граму окрашиваются отрицательно, лучше окрашиваются по Романовскому–Гимзе. Размножаются путем бинарного деления, некоторые способны к почкованию и сегментации.

Колонии мелкие с приподнятым центром («яичница глазунья»), врастают в среду. На поверхности колоний располагаются крупные, часто вакуолизированные клетки, в глубине – мелкие, оптически плотные организмы.

Методы микроскопии. В световом микроскопе можно обнаружить лишь самые большие формы и виды микоплазм, размеры которых превышают 0,2 мкм в длину и в поперечнике. В живом состоянии их изучают в темном поле и фазово–контрастном микроскопе, ультраструктурные элементы выявляют при электронной микроскопии.

2. Антитоксические сыворотки применяются для профилактики и лечения инфекций, в основе развития которых лежит действие экзотоксинов (столбняк, дифтерия, ботулизм, газовая гангрена и стафилококкозы), нейтрализуя его и таким образом обеспечивая лечебно-профилактический эффект. Антибактериальные сыворотки, за исключением противосибиреязвенного глобулина, в настоящее время практически не используются в связи с их малой эффективностью.  Антивирусные сыворотки применяются для профилактики и лечения кори, гриппа, бешенства, клещевого энцефалита, гепатита, а также возможных поствакцинальных осложнений после введения вакцин против этих инфекций. Некоторые иммуноглобулины получают от переболевших или привитых людей (коревой, стафилококковый и др.). В нашей стране иммуноглобулины выпускают в виде 10% раствора в ампулах.  В настоящее время на практике используются следующие лечебно-профилактические сыворотки и глобулины, как гетерологичные, так и человеческие: противостолбнячные, противоботулинические (типов А, В и Е), противогангренозные (моновалентные), противодифтерийная, противогриппозные сыворотки, а также коревой, антирабический, против клещевого энцефалита гамма-глобулины, сибиреязвенный глобулин, лактоглобулин и др.  В последнее время из крови иммунизированных людей извлекают иммуноглобулины направленного действия, в которых соответствующие антитела находятся в повышенной концентрации. Такие гипериммунные глобулины выпускают для экстренной иммунопрофилактики гриппа, столбняка, бешенства, оспы, клещевого энцефалита, стафилококкозов.  Иммуноглобулины повышенной концентрации можно получить также при отборе доноров, в крови которых содержится (как результат перенесенной болезни или иммунизации) повышеннное количество антител.

3. Возбудитель сифилиса. Лабораторная диагностика сифилиса.

СПИРОХЕТЫ

Семейство Spirochaetaceae – патогенны 3 рода:

Treponema (возбудитель сифилиса – Т. pallidum, фрамбезии – Т. pallidum subsp. tenue, пинты – Т.carateum);

Borrelia (возбудитель эпидемического возвратного тифа – В. recurrentis, клещевого возвратного тифа – В. persica, В. hispanisa и др.)

Leptospira семейства Leptospiraceae (возбудитель лептоспироза – L. interrogans).

Спирохеты имеют штопорообразную извитую форму. Они отличаются друг от друга характером и числом завитков, длиной клеток, а также другими морфологическими и физиологическими признаками.

Все спирохеты – гр–. Большая их часть – свободно живущие микроорганизмы, в организме человека обитают как сапрофиты, патогенны немногие.

TREPONEMA PALLIDUM – открыта в 1905 г. Ф. Шаудином и Э. Гофманом.

Морфология. Спиралевидная (8–12 завитков), диной 6–12 мкм, в поперечнике – около 0,2 мкм. От концов клеток отходят по 3 жгутика. Плохо воспринимает анилиновые красители, т.к содержит мало нуклеопротеида в клетке. Только при длительном окрашивании по методу Романовского–Гимзы приобретает слабо-розовый цвет из-за чего и получила название «бледная».

При действии неблагоприятных факторов (лечебных препаратов) преобразуется в L-форму, образуют цисты (свернутые в шар, покрытые непроницаемой муциновой оболочкой). Цисты могут длительное время находиться в организме больного, не проявляя патогенности. При благоприятных для них условиях цисты становятся спиралевидными, размножаются и восстанавливают свою патогенность.

Очень требовательна к составу искусственных питательных сред и на обычных средах не размножается, растет на средах, содержащих почечную или мозговую ткань в строго анаэробных условиях. В результате длительного культивирования происходит потеря вирулентности и изменение других биологических свойств (БХ, физиологических). Для сохранения исходных свойств трепонем их пассируют на кроликах – в ткани яичек животных, где они хорошо размножаются.

АГ. ПС, липидные и белковые комплексы.

Экология и распространение. Организм человека, животных в естественных условиях не болеют. Заражение – половым путем и редко через предметы обихода. Попадая в окружающую человека среду быстро погибают, малоустойчивы к высыханию, изменениям температуры и действию химических веществ, к тяжелым Ме (Hg, Bi, As), кислотам и обычным дезинфектантам.

Патогенез. Экспериментальное заражение лабораторных животных (крыс, мышей, морских свинок) создает бессимптомную инфекцию. Заражение кроликов в кожу или яичко позволяет размножить, накопить необходимое количество трепонем. Эта модель позволяет сохранять исходные биологические свойства культур, выделенных от больных, и изучать воздействие лекарств и др. Способность трепонем противостоять фагоцитозу, активно внедряться в ткани при повреждающем действии эндотоксина обеспечивает развитие патологического процесса. После инкубационного периода (в среднем 24–60 дней), на месте внедрения возбудителя возникает безболезненный плотный инфильтрат – твердый шанкр и регионарный аденит (плотный увеличенный лимфоузел). Это – первичный период, он продолжается 6 нед. Возбудитель размножается, накапливается в большом количестве в первичном очаге.

Затем трепонемы проникают в кровь, возникает генерализация, которая сопровождается высыпаниями на коже и слизистых оболочках. Это – вторичный период, возбудитель содержится в элементах сыпи, больной опасен для окружающих. Без лечения период продолжается 2–3 года.

Третичный период – в органах и тканях обнаруживаются инфекционные гранулемы (гуммы), наступает у нелеченых больных. Этот период продолжается несколько лет. При отсутствии кожных высыпаний больной малоопасен. Возможно поражение ЦНС (прогрессивный паралич) или спинного мозга (спинная сухотка). В этот период возбудители обнаруживаются в огромном количестве в ткани мозга.

Иммунитет. Восприимчивость человека к сифилису высока. Иммунитет характеризуется защитными клеточными реакциями, способствующими фиксации трепонем и образованию гранулем, но не элиминации возбудителя. Развивается инфекционная аллергия (можно выявить внутрикожным введением убитой взвеси тканевых трепонем). На высоте иммунного ответа трепонемы образуют цисты (локализуются в стенке кровеносных сосудов), вследствие чего болезнь переходит в стадию ремиссии. При снижении напряженности иммунитета происходит возврат в вегетативную стадию, размножение  рецидивы.

Образующиеся АТ не обладают защитными свойствами. Способность одних АТ (реагинов) вступать в реакцию с кардиолипиновым АГ используется в серодиагностике сифилиса.

Перенесенное заболевание не оставляет невосприимчивости. После излечения возможно повторное заболевание.

Лабораторная диагностика. В первичном периоде сифилиса, когда имеется твердый шанкр, диагноз подтверждается бактериоскопией мазков из тканевой жидкости, в которых обнаруживают бледную трепонему. С 4–5 недели от момента возникновения твердого шанкра, когда начинается серопозитивный период сифилиса, берут кровь, и диагноз заболевания подтверждается постановкой серологической реакции Вассермана.

Бактериоскопическое исследование тканевой жидкости твердого шанкра. Для ее получения язву очищают стерильным ватным тампоном, смоченным изотоническим раствором натрия хлорида. Затем дно шанкра раздражают кончиком скальпеля и выступающую при надавливании жидкость набирают в капилляр пастеровской пипетки, наносят на предметное стекло и, сделав раздавленную каплю, микроскопируют в темном поле. Трепонема сифилиса обладает медленным поступательно–сгибательным движением. Ее легко отдифференцировать от часто встречающейся на гениталиях непатогенной Borrelia refringens, имеющей крупные завитки и не совершающей сгибательных движений. Если шанкр располагается на губах, бледную трепонема практически невозможно отличить от находящейся в полости рта сапрофитической Treponema microdentium.В таких случаях исследуют пунктаты регионарных лимфатических узлов, в которых может быть только трепонема сифилиса.

Параллельно изучают мазки. Фиксируют их смесью Никифорова. Окрашивают по Романовскому–Гимзе в течение 2–4 ч. Бледная трепонема приобретает бледно–розовый, а B. refringens красновато–фиолетовый цвет.

Во втором периоде заболевания таким же образом исследуют различные кожные высыпания, но обнаружить в них бледную трепонему удается крайне редко. Зато в крови больных при вторичном сифилисе становится легко выявить специфические иммуноглобулины и вассермановские аутоантитела, реагирующие соответственно с трепонемными и кардиолипиновыми антигенами.

Реакция Вассермана. В серодиагностике сифилиса наиболее хорошо апробирована реакция Вассермана (РВ). Для ее постановки от больных получают сыворотку крови, а при прогрессивном параличе или спинной сухотке, кроме того, спинномозговую жидкость. Ставится РВ так же, как и РСК, но из–за отсутствия чистой культуры бледной трепонемы в качестве антигенов в ней применяют липиды–гаптены: 1) спиртовые экстракты печени погибшего сифилитического плода и тестикулярной ткани зараженного кролика (специфические антигены) и 2) экстракты сердца быка, которые называют неспецифическим кардиолипиновым антигеном.

Профилактика и лечение. Специфической профилактики сифилиса нет. В арсенал современных противосифилитических средств входят пенициллин и его дюрантные производные (бициллины), тетрациклин, олететрин, эритромицин, препараты висмута, производные йода. Лечение сифилиса обычно состоит из нескольких циклов, но используют также непрерывный (перманентный) метод терапии антибиотиками, особенно при выявлении свежих форм заболевания,

4. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР, PCR) изобрёл в 1983 году Кэри Мюллис (американский учёный). Впоследствии он получил за это изобретение Нобелевскую премию. В настоящее время ПЦР-диагностика является, одним из самых точных и чувствительных методов диагностики инфекционных заболеваний.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

В основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). В результате нарабатываются количества ДНК, достаточные для визуальной детекции. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце.

Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК), и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.

Специфичность и применение  ПЦР - метод молекулярной диагностики, ставший для ряда инфекций «золотым стандартом», проверен временем и тщательно апробирован клинически. Метод ПЦР позволяет определить наличие возбудителя заболевания, даже если в пробе присутствует всего несколько молекул ДНК возбудителя.

ПЦР позволяет диагностировать наличие долго растущих возбудителей, не прибегая к трудоёмким микробиологическим методам, что особенно актуально в гинекологии и урологии при диагностике урогенитальных инфекций, передающихся половым путем (ИППП).

Также, этим методом проводят диагностику вирусных инфекций, таких как гепатиты, ВИЧ и др. Чувствительность метода значительно превосходит таковую у иммунохомических и микробиологических методов, а принцип метода позволяет диагностировать наличие инфекций со значительной антигенной изменчивостью.

Специфичность ПЦР при использовании технологии PCR даже для всех вирусных, хламидийных, микоплазменных, уреаплазменных и большинства других бактериальных инфекций достигает 100%. Метод ПЦР позволяет выявлять даже единичные клетки бактерий или вирусов. ПЦР-диагностика обнаруживает наличие возбудителей инфекционных заболеваний в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.

Особенно эффективен метод ПЦР для диагностики трудно культивируемых, некультивируемых и скрыто существующих форм микроорганизмов, с которыми часто приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, поскольку этот метод позволяет избежать сложностей, связанных с выращиванием таких микроорганизмов в лабораторных условиях.

Применение ПЦР-диагностики также очень эффективно в отношении возбудителей с высокой антигенной изменчивостью и внутриклеточных паразитов. Методом ПЦР возможно выявление возбудителей не только в клиническом материале, полученном от больного, но и в материале, получаемом из объектов внешней среды (вода, почва и т. д.). В урологической и гинекологической практике - для выявления хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, герпеса, гарднереллёза, микоплазменной инфекции, ВПЧ - вирусов папилломы человека; в пульмонологии - для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулёза; в гастроэнтерологии - для выявления хеликобактериоза; в клинике инфекционных заболеваний - в качестве экспресс-метода диагностики сальмонеллёза, дифтерии, вирусных гепатитов В, С и G; в гематологии - для выявления цитомегаловирусной инфекции, онковирусов.

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами - короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18 - 30 букв. Каждый из праймеров сопоставим (комплементарен) с одной из цепей двуцепочечной матрицы, обрамляя начало и конец амплифицируемого участка.

После соединения (гибридизации) матрицы с праймером (отжиг), последний служит затравкой для ДНК-полимеразы при синтезе комплементарной цепи матрицы.

Проведение ПЦР  Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются следующие компоненты:

• ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать;

• два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента;

• термостабильная ДНК-полимераза;

• дезоксинуклеотидтрифосфаты (A, G, C, T);

• ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы;

• буферный раствор.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1°C. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое. Добавление специфичеких ферментов может увеличить выход ПЦР-реакции.

Ход реакции  Обычно при проведении ПЦР выполняется 20 - 35 циклов, каждый из которых состоит из трех стадий. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94 - 96°C (или до 98°C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5 - 2 минуты, чтобы цепи ДНК разошлись. Эта стадия называетсяденатурацией — разрушаются водородные связи между двумя цепями. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2 - 5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров.

Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом. Температура отжига зависит от праймеров и обычно выбирается на 4 - 5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5 - 2 минут. 

ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадияэлонгации. Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы наиболее активны при 72°C. Время элонгации зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины амплифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований. После окончания всех циклов часто проводят дополнительную стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепочечные фрагменты. Эта стадия длится 10 - 15 мин.

Подготовка материала к исследованию и транспорт его в лабораторию  Для успешного проведения анализа важно правильно собрать материал у пациента и правильно провести его подготовку. Известно, что в лабораторной диагностике большинство ошибок (до 70%) совершается именно на этапе пробоподготовки. Для взятия крови в лаборатории ИНВИТРО  в настоящее время применяются вакуумные системы, которые с одной стороны минимально травмируют пациента, а с другой - позволяют произвести взятие материала таким образом, что он не контактирует ни с персоналом, ни с окружающей средой. Это позволяет избежать контаминации (загрязнения) материала и обеспечивает объективность анализа ПЦР.