Микроб билеты / Билет 20

Билет 20

1. Окраска микроорганизмов — наиболее распространенный в микробиологии комплекс методов и приемов, применяемый для обнаружения и идентификации микроорганизмов с помощью микроскопа. В нативном (естественном) состояниибактерии имеют такой же коэффициент преломления, как и стекло, поэтому они невидимы при микроскопическом исследовании. Окраска микроорганизмов позволяет изучить морфологические особенности микробов, а иногда точно определить их вид, например некоторые микробы — одинаковые по морфологии — различно окрашиваются с помощью одних и тех же сложных методов окраски. Окраска микроорганизмов представляет собой физико-химический процесс соединения химических компонентов клетки с краской. В ряде случаев различные части микробной клетки (ядро, цитоплазма) избирательно окрашиваются различными красителями. Наиболее пригодными для окраски микроорганизмов являются анилиновые краски, главным образом основные и нейтральные, кислые краски менее пригодны. Приготовление окрашенного препарата включает ряд этапов: 1) приготовление мазка; 2) высушивание мазка; 3) фиксацию мазка; 4) окраску; 5) высушивание. Мазок готовят на чистых предметных стеклах, на середину которых наносят небольшую каплю воды и в нее с помощью бактериологической петли помещают исследуемый материал. Материал распределяют на стекле равномерным тонким слоем, размер мазка —1—2 см². Препарат обычно высушивают при комнатной температуре на воздухе. Для ускорения высушивания допускается подогревание мазка в струе теплого воздуха высоко над пламенем горелки. Высушенный мазок подвергается фиксации, при которой мазок прикрепляется к стеклу (фиксируется), а микробы становятся более восприимчивыми к окраске. Способов фиксации много. Наиболее простой и распространенный — фиксация жаром — нагревание на пламени горелки (препарат проводят несколько раз через наиболее горячую часть пламени горелки). В ряде случаев прибегают к фиксации жидкостями (этиловый или метиловый спирт, ацетон, смесь равных объемов спирта иэфира — по Никифорову). После фиксации мазок окрашивают. Количество краски, наносимое на препарат, должно быть таким, чтобы покрыть всю поверхность мазка. По истечении срока окрашивания (2—5 мин.) краску сливают и препарат промывают водой. Существуют простые, сложные и дифференциальные способы окрашивания микробов. При простой окраске обычно употребляют одну краску, чаще всего красную — фуксин, или синюю — метиленовый синий. Фуксин красит быстрее (1—2 мин.), метиленовый синий — медленнее (3—5 мин.). Фуксин приготовляют в виде концентрированного карболового раствора (фуксин Циля), очень стойкого и пригодного для окраски в течение многих месяцев. Метиленовый синий приготовляется заранее в насыщенном спиртовом растворе, который стоек и может долго храниться. Сложные способы окраски, при которых применяются два или более красителя, являются ценными методами, используемыми в микробиологической диагностике инфекционных болезней. Наибольшее практическое значение имеет окраска по Граму (см. Грома метод окраски) и окраска по Цилю. Метод окраски по Цилю является основным для окраски кислотоустойчивых бактерий. Здесь применяются два красителя: карболовый фуксин Циля и метиленовый синий. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, все некислотоустойчивые формы — в синий. Метод Бениньетти является одним из способов окраски жгутиков. Протрава и окраска одним из красящих растворов, составляемых ex tempore (по мере надобности): I — сульфат цинка — 1 г, танин — 10 г, дистиллированная вода — 100 мл и II — насыщенный спиртовой раствор генцианвиолета. Смешивают 5 мл раствора I и 3 мл раствора II, наносят на препарат, нагревают до появления паров, промывают водой, высушивают и рассматривают. Из других сложных методов применяется так называемый негативный способ Бурри (см. Бурри метод), способ Гинса для выявления капсул (см. Гинса метод) и ряд других

2 Реакция агглютинации — простая по постановке реакция, при которой происходит связыва­ние антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекулярных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изо­тонического раствора натрия хлорида.

Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировоч­ная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осад­ка (клетки, «склеенные» антителами, име ющими два или более антигенсвязывающих центра — рис. 13.1). РА используют для:

1) определения антител в сыворотке крови боль­ных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реак­ция Видаля) и других инфекционных болезнях;

2)  определения возбудителя, выделенного от больного;

3)  определения групп крови с использова­нием моноклональных антител против алло-антигенов эритроцитов.

Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации: к разве­дениям сыворотки крови больного добавля­ют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 ˚С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.

Характер и скорость агглютинации зави­сят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диагностикумов (О- и H-антигенов) со специ­фическими антителами. Реакция агглютина­ции с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернис­той агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые фор­малином, сохранившие термолабильный жгу­тиковый Н-антиген) — крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентиро­вочную реакцию агглютинации, применяя диа­гностические  антитела  (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя.    Ориентировочную   реакцию проводят на предметном стекле. К капле диа­гностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больно­го. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микроба­ми хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увели­чивающимися разведениями агглютинирую­щей сыворотки,  к которым добавляют по 2—3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости.  Реакцию считают положительной, если агглютинация отмеча­ется в разведении, близком к титру диагнос­тической сыворотки. Одновременно учитыва­ют контроли: сыворотка, разведенная изото­ническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе — равномерно мутной, без осадка.

1. Разные родственные бактерии могут агглю­тинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудня­ет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыво­ротками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыво­ротках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии

3 Менингококки: антропонозная острая бактериальная инфекционная болезнь с аспирационным механизмом передачи возбудителя. Характеризуется поражением слизистой оболочки носоглотки и генерализацией в виде специфической септицемии и гнойного лептоменингита.Возбудитель - менингококк Neisseria meningitidis, семейство Neisseriaceae ,род Neisseria; округлый, неподвижный, грамотрицательный, хорошо окрашивается анилиновыми красителями. Клеточная стенка содержит липополисахаридный эндотоксин. По антигенной структуре различают 12 серогрупп менингококко: основные (А, В, С) и дополнительные (X, Y, Z, 29E, W135, H, I, K, L). размножается на средах, содержащих белок или специальный набор аминокислот; мало устойчив к воздействию факторов окружающей среды: быстро погибает при высыхании, охлажденни ниже температуры 22° С, при 55° С - через 5 мин, под воздействием 0,01 % раствора хлорамина, 1 % фенола, 0,1 % раствора перекиси водорода - через 2-3 мин.Резервуар и источники возбудителя: человек, больной генерализованной формой, острым назофарингитом, и здоровые носители. В периоды спорадической заболеваемости 1-3 % населения являются носителями менингококка, в эпидемических очагах - до 20-30 %. Наиболее высокий уровень носительства наблюдается среди взрослых, наименьший - среди детей, минимальный - среди детей до 2 лет. Больной начинает выделять возбудителя уже в продромальном периоде, когда возникает назофарингит, который может продолжаться 3-4 нед. С переходом воспалительного процесса на мозговые оболочки больной перестает быть выделителем возбудителя. Длительность острого здорового носительства составляет в среднем 2-3 нед, при хронических воспалительных процессах носоглотки (2-3 % случаев) - 6 нед и более.Механизм передачи возбудителя аспирационный; путь передачи - воздушно-капельный. Передача происходит только при тесном и длительном общении с источником возбудителя, что объясняется неустойчивостью менингококка.Основные эпидемиологические признаки: Распространение инфекции носит убиквитарный характер, регистрируется в виде спорадической, групповой и эпидемической заболеваемости. Инкубационный период при генерализованных формах болезни от 1 до 10 дней, чаще 2-3 дня; при локализованных формах неизвестен.Основные клинические признаки: Различают следующие клинические формы: локализованные (носительство и острый назофарингит), генерализованные (менингококкемия, менингит, менингоэнцефалит) и редкие (эндокардит, полиартрит, пневмония, иридоциклит).Острый назофарингит чаще всего протекает в легкой форме с субфебрильной температурой в течение 2-3 дней и слабой интоксикацией. При среднетяжелой форме температура тела достигает 38-38,5° С, держится 2-3 дня, реже 5 дней; беспокоят головная боль, слабость, боли в горле, заложенность носа. При тяжелом течении температура тела поднимается до 39° С и выше; помимо головной боли, наблюдаются головокружение, рвота, часто - менингеальные симптомы.Характерные черты генерализированных форм: острое начало, лихорадка, озноб, резкая головная боль. Боли в мышцах и суставах, часты рвоты. Отмечаются гиперестезия, светобоязнь. Быстро нарастают менингеальные явления: ригидность затылочных мышц. Нередко наблюдаются психомоторное возбуждение, бессонница или сонливость, бред. Наиболее характерным признаком менингококкемии является геморрагическая сыпь звездчатой формы, главным образом на дистальных отделах конечностей, ягодицах, боковых поверхностях туловища. Эта форма болезни может протекать молниеносно, с инфекционно-токсическим шоком и летальным исходом.В связи с широким амбулаторным применением антибиотиков возросло количество атипических форм.Лабораторная диагностика заключается в микробиологическом исследовании СМЖ, крови (5-10 мл), носоглоточной слизи. В мазках, окрашенных обычными анилиновыми красителями (метиленовый синий, основной фуксин), менингококко располагаются парно. Культуру микроорганизма получают посевом на полужидкий агар и на среду с ристомицином, который подавляет рост грамположительных кокков. Культивирование менингококков и выделение их в чистой культуре удается лишь у 30-40 % больных. В связи с этим для обнаружения антигенов возбудителя в спинномозговой жидкости больных используют серологические методы экспресс -диагностики: коагглютинация, РПГА, ИФА, латексагглютинация (ЛА). Серогруппа штаммов возбудителей, выделенных из СМЖ, крови и носоглотки, определяется с помощью теста бактериальной агглютинации с группоспецифическими антисыворотками. Профилактика и лечение: профилактика – вакцинация – химическая вакцина, которая получена из капсульных полисахаридов типа А и С и обладают протективными св-вами. У детей до 2-3 лет антиген С не иммуногенен (не создает иммунологической памяти). Лечение – антибиотикотерапия..

4 Вирусы — мельчайшие микробы, не имеющие клеточного строения, белоксинтезирующей системы, содержащие только ДНК или РНК. Относятся к царству Vira. Являясь облигатными внутриклеточными паразитами, вирусы размножаются в ци­топлазме или ядре клетки. Они — автономные генетические структуры. Отличаются особым — разобщенным (дисъюнктивным) способом размножения (репродукции): в клетке от­дельно синтезируются нуклеиновые кислоты вирусов и их белки, затем происходит их сборка в вирусные частицы. Сформированная вирусная частица называется вирионом.

Форма вирионов может быть раз­личной: палочковидной (вирус табачной мозаики), пулевидной (вирус бешенства), сферической (вирусы полиомиели­та, ВИЧ), в виде сперматозоида (многие бактериофаги). Различают просто устроенные и сложно устроенные вирусы.Простые, или безоболочечные, вирусысостоят из нуклеиновой кисло­ты и белковой оболочки, называемой капсидом. Капсид состоит из повторяющихся морфологических субъединиц — капсомеров. Нуклеиновая кислота и капсид взаимодействуют друг с другом, образуя нуклеокапсид.Сложные, или оболочечные, вирусы снаружи капсида окружены ли-попротеиновой оболочкой (суперкапсидом, или пеплосом). Эта оболоч­ка является производной структурой от мембран вирус-инфицированной клетки. На оболочке вируса расположены гликопротеиновые ши­пы, или шипики (пепломеры). Под оболочкой некоторых вирусов нахо­дится матриксный М-белок.

Капсид и суперкапсид защищают вирионы от влияния окру­жающей среды, обусловливают избирательное взаимодействие (адсорбцию) с клетками, определяют антигенные и иммуногенные свойства вирионов. Внутренние структуры вирусов называ­ются сердцевиной.

спираль­ный, икосаэдрический (кубический) или слож­ный тип симметрии. Икосаэдрический тип сим­метрии обусловлен образованием изометричес­ки полого тела из капсида, содержащего вирус­ную нуклеиновую кислоту (например, у вирусов гепатита А, герпеса, полиомиелита). Спираль­ный тип симметрии обусловлен винтообразной структурой нуклеокапсида (например, у вируса гриппа).Включения — скопление вирионов или отдельных их компонентов в цитоплазме или ядре клеток, выяв­ляемые под микроскопом при специальном окрашива­нии. Вирус натуральной оспы образует цитоплазмати-ческие включения — тельца Гварниери; вирусы герпеса и аденовирусы — внутриядерные включения.

Размеры вирусов определяют с помощью электронной мик­роскопии, методом ультрафильтрации через фильтры с извест­ным диаметром пор, методом ультрацентрифугирования. Одним из самых мелких вирусов является вирус полиомиелита (около 20 нм), наиболее крупным — натуральной оспы (около 350 нм)Вирусы имеют уникальный геном, так как содержат либо ДНК, либо РНК. Поэтому различают ДНК-содержащие и РНК-содержащие вирусы. Они обычно гаплоидны, т.е. име­ют один набор генов. Геном вирусов представлен различными видами нуклеиновых кислот: двунитчатыми, однонитчатыми, линейными, кольцевыми, фрагментированными. Геном вирусов способен включаться в состав генетического аппарата клетки в виде провируса, проявляя себя генетическим паразитом клетки. Нуклеиновые кислоты некоторых вирусов (вирусы герпеса и др.) могут находиться в цитоплазме инфициро­ванных клеток, напоминая плазмиды.Тип симметрии. Капсид или нуклеокапсид могут иметь спираль­ный, икосаэдрический (кубический) или слож­ный тип симметрии. Икосаэдрический тип сим­метрии обусловлен образованием изометричес­ки полого тела из капсида, содержащего вирус­ную нуклеиновую кислоту (например, у вирусов гепатита А, герпеса, полиомиелита). Спираль­ный тип симметрии обусловлен винтообразной структурой нуклеокапсида (например, у вируса гриппа).

В основу классификации вирусов положены следующие кате­гории:

•  тип нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), ее структура, ко­личество нитей (одна или две), особенности воспроизводства вирусного генома;

•  размер и морфология вирионов, количество капсомеров и тип симметрии;

•  наличие суперкапсида;

•  чувствительность к эфиру и дезоксихолату;

•  место размножения в клетке;

•  антигенные свойства и пр.