Микроб билеты / Билет 30

Билет 30

1. ПЦР - диагностика является самым современным, быстрым и точным методом исследования в микробиологии для выявления многих заболеваний. ПЦР - диагностика обнаруживает наличие инфекционных возбудителей в тех случаях, когда другими методами (иммунологическими, бактериологическими, микроскопическими) это сделать невозможно.

Большая точность метода достигается за счет высокой специфичности ПЦР - диагностики, так как в исследуемом материале выявляется уникальный фрагмент ДНК или РНК, характерный только для данного возбудителя, что прямо говорит о его присутствии в организме.

ПЦР - диагностика состоит из 3 основных процедур: подготовки исследуемой пробы материала, которая сводится к выделению ДНК или РНК, собственно полимеразной цепной реакции и детекции продукта ПЦР.

При этом чужеродный генетический материал многократно копируется в пробирке при помощи ДНК-полимеразы, а затем миллионные количества копий специфических фрагментов ДНК регистрируются визуально.

Это позволяет при ПЦР - диагностике обнаруживать даже единичные клетки бактерий или вирусов. Или в такой сложной ситуации, когда нужно обнаружить возбудителей с высокой антигенной изменчивостью или паразитирующих внутри клетки - их очень трудно обнаружить другими методами.

А быстрота исследования определяется тем, что не требуется долго выделять и выращивать возбудителя, чтобы найти его - процесс стандартизирован и автоматизирован вплоть до подготовки пробы для выделения нуклеиновой кислоты из бактерии или вируса, что одновременно сводит к минимуму вероятность ошибок, связанных с ручной подготовкой и тестированием проб. Результат может быть получен в течение нескольких часов, и при положительном ответе ПЦР - диагностики обычно выражается по четырехбальной шкале от одного до четырех плюсов.

ПЦР - диагностика универсальна и тем, что позволяет обнаружить чужеродное ДНК в самых различных биологических тканях - слизи, моче, крови, мокроте, соскобе эпителиальных клеток. И будут определены все возбудители, ДНК которых присутствовали в исследуемом материале. Особенную популярность ПЦР - диагностика приобрела для выявления инфекций, передаваемых половым путем, особенно скрытых или хронических - хламидиоза, уреаплазмоза, гонореи, гарднереллеза, микоплазменной инфекции. Их возбудителей как раз труднее всего выявить классическим путем выращивания клеток в лабораторных условиях, да и антитела в серологических реакциях могут мало определяться.

А исследовав соскоб эпителия уретры или канала шейки матки, (в случае необходимости берется и другой материал (секрет простаты, моча и т. д.), можно получить точные признаки наличия именно той или иной инфекции, так как размножению подвергается только ДНК бактерии, а не сама бактерия.

Также с помощью ПЦР - диагностики исследуются вирусы - такие, как вирус папилломы человека, для чего берется соскоб папилломатозных элементов, а для ПЦР - диагностики вирусных гепатитов производится забор крови из вены. Здесь же нужно не забыть о ПЦР - диагностике ВИЧ, особенно врожденной ВИЧ- инфекции.

Реже ПЦР - диагностика применяется для дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных пневмоний, туберкулеза, дифтерии, для выявления геликобактериоза в гастроэнтерологии, для определения цитомегаловирусной инфекции и онковирусов.

Но выявление инфекционных заболеваний, оценка их вирулентности и устойчивости к антибиотикам - только одна из возможностей ПЦР - диагностики. Она позволяет также проводить генетическую дактилоскопию, пренатальную диагностику и многое другое. Точечные мутации генного материала ведут к возникновению различных болезней, которые передаются по поколениям (например, наследственная предрасположенность к некоторым видам рака), или являются причиной детской смертности и инвалидности. Современные методы пренатальной диагностики или скрининга носительства призваны помочь решить проблему путем своевременного выявления поврежденной ДНК. ПЦР - диагностика и в этом случае доказывает свою ценность. Несмотря на то, что ПЦР- диагностика является высокоспецифичным методом, при ней также возможны ложно-положительные результаты, связанные с попаданием в материал исследования чужой ДНК и ее копий через предметы и реагенты. Предупреждается это правильной организацией исследования, с соблюдением ряда правил.

Например, учет продуктов ПЦР- диагностики должен проводиться в изолированной комнате сотрудником, не производящим обработку образцов и не готовящим реактивы для ПЦР - диагностики. Приготовление основных растворов также должно производится в отдельной чистой комнате. Все растворы должны храниться и использоваться в небольших порциях. Необходимо постоянно использовать лабораторные контроли и периодически применять зашифрованные отрицательные и положительные контрольные образцы для оценки специфичности и чувствительности ПЦР - диагностики. Также в настоящее время хорошо апробированы и применяются в ПЦР- диагностике методы ферментативного и химического предупреждения ложно-положительных результатов, когда амплификоны разрушаются определенными ферментами или повреждаются ультрафиолетовыми лучами, к которым становятся чувствительны под действием химических соединений.

2. Иммунотерапия — это использование иммунологических закономерностей для лечения больных. При лечении острых тяжелых генерализованных форм инфекционных заболеваний, особенно тех, возбудители которых продуцируют экзотоксин, возникает, как правило, необходимость экстренного создания пассивного искусственного приобретенного иммунитета. Для этих иелей используются следующие антительные препараты: • антитоксические и антибактериальные (антимикробные) иммунные сыворотки; • иммуноглобулины (гамма-глобулины); • плазма. Иммунные сыворотки, используемые в практике специфической профилактики и терапии инфекционных болезней, получают от иммунизированных животных, переболевших людей или специально иммунизированных доноров. 2. Антитоксические сыворотки содержат антитела против экзотоксинов. Их получают путем гипериммунизации животных (лошадей) анатоксином. Активность таких сывороток измеряется в АЕ (антитоксических единицах) или ME (международных единицах) — это минимальное количество сыворотки, способное нейтрализовать определенное количество (обычно 100 DLM) токсина для животных определенного вида и определенной массы. В настоящее время в России антитоксические сыворотки: • противодифтерийная; • противостолбнячная; широко используются следующие • противогангренозная; • противоботулиническая. Применение антитоксических сывороток при лечении соответствующих инфекций обязательно. 3. Антимикробные сыворотки содержат антитела против клеточных антигенов возбудителя. Их получают иммунизацией животных клетками соответствующих возбудителей и дозируют в миллилитрах. Антимикробные сыворотки могут применяться при лечении: • сибирской язвы; • чумы; • стрептококковых инфекций; • стафилококковой инфекции; • синегнойной инфекции. Их назначение определяется тяжестью течения заболевания и, в отличие от антитоксических, не является обязательным. При лечении больных с хроническими, длительно, вяло текущими формами инфекционных заболеваний возникает необходимость стимулировать собственные механизмы специфической зашиты путем введения различных антигенных препаратов и создания активного приобретенного искусственного иммунитета (иммунотерапия антигенными препаратами). Для этих целей используются в основном лечебные вакцины и значительно реже — аутовакцины или стафилококковый анатоксин. Убитые лечебные вакцины — дизентерийная, гонококковая (го-новакцина), бруцеллезная, стафилококковая — используются довольно давно. 4. Особую, отдельную группу лечебных вакцин представляют аутовакцины, приготовленные из убитых прогреванием при 70—80 °С в течение 1 ч штаммов возбудителей, выделенных в результате бактериологического исследования от данного больного. Аутовакцины имеют определенные преимущества: они создают игены конкретного возбудителя, учитывая его штаммовые особенности. 5. При проведении иммунотерапии необходимо учитывать несколько важных моментов: • противовирусные антительные препараты не используются, так как антитела не действуют на внутриклеточные формы вирусов; • лечение путем введения антитоксических сывороток должно быть начато как можно раньше, не дожидаясь результатов микробиологического диагноза, так как серотерапия ими эффективна только до адсорбции (фиксации) токсина клетками организма; • антитоксические иммунные сыворотки часто содержат лошадиный белок, и введение таких сывороток пациентам допустимо лишь в случае отсутствия в течение 20-30 мин выраженной реакции на лошадиную сыворотку (в разведении 1 : 100, в объеме 1 мл); • в некоторых случаях возможно одновременное введение и антигенных, и антительных препаратов (столбнячный анатоксин с противостолбнячным иммуноглобулином при первичной хирургической обработке раны); • клинически доказано, что использование препаратов иммуноглобулинов, полученных от иммунизированных людей, при иммунотерапии гнойно-воспалительных заболеваний стафилококковой этиологии и столбняка более эффективно, чем использование соответствующих иммунных антитоксических сывороток (лошадиных).

3. Морфология и биологические свойства. Пневмококки представляют собой парно расположенные кокки овальной, слегка вытянутой ланцетовидной формы, напоминающие пламя свечи. Они могут располагаться также короткими цепочками, напоминая стрептококки. В организме человека и животных образуют капсулу; при выращивании на искусственных средах она отсутствует. Неподвижны, спор не образуют, грамположительны.

По типу дыхания — факультативные аэробы. На простых питательных средах не растут или дают скудный рост. Выращивают их на средах с добавлением белка: кровяных, сывороточных, с асцитической жидкостью. На кровяном агаре колонии пневмококков мелкие, напоминающие росинки, прозрачные в проходящем свете, с вдавленным центром, окружены зоной неполного гемолиза, зеленоватого оттенка, сходные с колониями зеленящего стрептококка. На жидких средах дают нежное помутнение, иногда образуя осадок. Биохимически довольно активны: разлагают глюкозу, лактозу, мальтозу, инулин и другие углеводы с образованием кислоты, не разжижают желатина, не образуют индола. Расщепление инулина является дифференциально-диагностическим признаком, помогающим отличить пневмококки от стрептококков, которые инулин не разлагают. Важным отличительным признаком служит способность пневмококков растворяться в желчи, в то время как стрептококки хорошо в ней сохраняются.

Токсинбобразование. Пневмококки содержат эндотоксин, а также гемотоксин, фибринолизин, лейкоцидин, гиалуронидазу. Вирулентность пневмококка связана с веществом капсулы. В ней находится антифагин, препятствующий фагоцитированию лейкоцитами пневмококков.

Устойчивость. Пневмококки малоустойчивы во внешней среде. Они быстро теряют жизнеспособность под действием различных дезинфицирующих веществ. При температуре 60°С погибают в течение 10 мин. На искусственных питательных средах сохраняются не более 6— 7 дней. Вместе с тем пневмококки довольно устойчивы к высушиванию: в высушенной мокроте остаются жизнеспособными до 2 мес. Под действием оптохина в концентрации 1 : 1 ООО ООО быстро погибают.

Антигенная структура. У всех пневмококков имеется один общий видовой протеиновый антиген, находящийся в цитоплазме. В капсуле пневмококков имеются различные полисахариды, специфичные для  каждого типа. В настоящее время пневмококки делят по капсульному антигену на 80 типов. Считают, что наибольшее значение в патологии человека имеют I, II и III типы, но с каждым годом выявляется патогенность новых типов.

Патогенность. Пневмококки могут вызывать заболевания у телят, поросят, ягнят, собак. В лабораторных условиях наиболее восприимчивы белые мыши и кролики. При парентеральном введении белым мышам небольшого количества патологического материала или чистой культуры пневмококка у них развивается картина септического заболевания, приводящая через 18—24 ч к смерти животного. В крови и органах при микроскопии видны пневмококки в капсулах.

Патогенез и клиника. Пневмококки являются возбудителями крупозной пневмонии у человека. Они могут также вызывать ползучую язву роговицы, катары верхних дыхательных путей, менингит, эндокардит, поражения суставов и другие заболевания. Вместе с тем пневмококки являются обитателями слизистой оболочки верхних дыхательных путей здорового человека. Установлено, что у здоровых носителей встречаются маловирулентные штаммы, не относящиеся к I, II и III типам, поэтому инфекция в большинстве случаев носит экзогенный характер и передается воздушно-капельным путем. Понижение сопротивляемости организма в результате переохлаждения, переутомления, перенесенного гриппа и другие неблагоприятные факторы способствуют возникновению заболевания. Входные ворота инфекции — слизистая оболочка верхних дыхательных путей. При крупозной пневмонии поражаются доли легкого или все легкое. Болезнь сопровождается высокой температурой, ознобом, сухим болезненным кашлем и другими симптомами. Микробные токсины поражают сосудистую и центральную нервную системы. В связи с успешным применением антибиотиков роль пневмококка в этиологии пневмоний резко снизилась.

Иммунитет. У людей довольно выражена естественная невосприимчивость к пневмококковой инфекции.

Об этом свидетельствует частое обнаружение пневмококков на слизистой оболочке верхних дыхательных путей здоровых лиц. После перенесенного заболевания иммунитет малонапряженный, кратковременный, типоспецифический. Перенесенная пневмококковая инфекция предрасполагает к повторным заболеваниям, так как пневмококки обладают сенсибилизирующими свойствами.

Микробиологическая диагностика. Материалом для исследования являются мокрота, кровь, мазок из зева, спинномозговая жидкость. Ввиду того что пневмококк быстро погибает, патологический материал необходимо как можно скорее доставить в лабораторию для исследования. Из этого материала готовят мазки, окрашивают их по Граму и по методу Гинса, а затем микроскопируют. Обнаружение ланцетовидных диплококков, окруженных бесцветной капсулой, дает основание предположить наличие пневмококков. Затем производят микробиологическое исследование патологического материала. С этой целью делают посев на кровяной агар и сывороточный бульон. Одновременно используют биологический метод, вводя внутрибрюшинно исследуемый материал двум белым мышам. Уже через 4-6 часов у них появляются первые признаки заболевания. Мышей под наркозом вскрывают или отсасывают пунктат из брюшной полости. Кусочки внутренних органов, кровь или пунктат засевают в сывороточный бульон и на кровяной агар. На следующий день просматривают посевы, отмечают характер роста, микроскопируют, выделяют чистую культуру. Для дифференциации от стрептококка делают посев исследуемой культуры в пробирку с 10% желчным бульоном и в среду с инулином. Если через 24 ч инкубации в термостате в пробирке с желчным бульоном произошло полное просветление среды (вследствие лизиса микробов), а в пробирке инулином— покраснение ее, указывающее на разложение инулина, выделенную культуру относят к пневмококкам. Для определения типа пневмококка ставят реакцию агглютинации с противопневмококковыми сыворотками,  Профилактика и лечение. Меры профилактики сводятся к закаливанию организма; следует избегать рез- ч кого охлаждения. Специфическую профилактику не проводят.

Для лечения с успехом используют сульфаниламидные препараты и антибиотики (пенициллин, тетрациклин).

4. Вирусологические методы исследования — методы изучения биологии вирусов и их идентификации. В вирусологии широко используются методы молекулярной биологии, с помощью которых удалось установить молекулярную структуру вирусных частиц, способы проникновения их в клетку и особенности репродукции вирусов, первичной структуры вирусных нуклеиновых кислот и белков. Развиваются методы определения последовательности составляющих элементов вирусных нуклеиновых кислот и аминокислот белка. Появляется возможность связать функции нуклеиновых кислот и кодируемых ими белков с последовательностью нуклеотидов и установить причины внутриклеточных процессов, играющих важную роль в патогенезе вирусной инфекции.

    Вирусологические методы исследования основаны также на иммунологических процессах (взаимодействие антигена с антителами), биологических свойствах вируса (способность к гемагглютинации, гемолизу, ферментативная активность), особенностях взаимодействия вируса с клеткой-хозяином (характер цитопатического эффекта, образование внутриклеточных включений и т.д.).

    В диагностике вирусных инфекций, при культивировании, выделении и идентификации вирусов, а также при получении вакцинных препаратов широко применяют метод культуры ткани и клеток. Используют первичные, вторичные, стабильные перевиваемые и диплоидные клеточные культуры. Первичные культуры получают при диспергировании ткани протеолитическими ферментами (трипсином, коллагеназой). Источником клеток могут быть ткани и органы (чаще почки) эмбрионов человека и животных. Суспензию клеток в питательной среде помещают в так называемые матрацы, бутыли или чашки Петри, где после прикрепления к поверхности сосуда клетки начинают размножаться. Для заражения вирусами используют обычно клеточный монослой. Питательную жидкость сливают, вносят вирусную суспензию в определенных разведениях и после контакта с клетками добавляют свежую питательную среду, обычно без сыворотки.