4 День исследования:
1. Учет результатов биохимических тестов.
После того как культура идентифицирована до вида у нее изучают ряд дополнительных признаков, таких как чувствительность к антибиотикам, токсигенность, наличие факторов вирулентности, плазмидный профиль, а также проводят внутривидовую дифференцировку.
2. Результаты биохимической идентификации являются основанием для проведения серологической идентификации. Серологическая идентификация выделенной культуры проводится в реакции агглютинации на стекле с помощью соответствующих иммунных адсорбированных сывороток, выбор которых определяется результатами биохимической идентификации.
Внутривидовая дифференциация это определение принадлежности штамма к тому или иному фаговару, бактериоциногеновару, бактериоциновару, биовару, резистовару и т.д. Она позволяет выявить эпидемиологичяеские связи между штаммами одного вида.
Идентификация выделенной культуры позволяет сделать заключение о том, какой микроорганизм является этиологическим фактором заболевания. При выделении условно-патогенных бактерий необходимо соблюдать критерии этиологической значимости:
- присутствие бактерий в материале из патологического очага в количестве не менее 105КОЕ мл /г;
- повторное выделение из материала той же культуры;
- нарастания титра антител в сыворотке крови больного к аутоштамму в 4 и более раза.
ВИРУСОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Вирусы размножаются лишь в живых клетках. В связи с этим культивирование вируса осуществляется в организме животного, куриного эмбриона или в культуре ткани
Культивирование вируса в организме животных. Чаще всего этот метод используют для выделения вирусов, не способных вызывать цитопатическое действие в культуре клеток и не способных размножаться в куриных эмбрионах (некоторые арбовирусы, вирус бешенства, вирусы ящура, вирусы Коксаки, вирусы лимфоцитарного хориоменингита). Исследуемый материал вносят в организм с учетом тропизма вируса к определенным тканям.
Культивирование в куриных эмбрионах. В тканях эмбриона, его оболочках, желточном мешке размножаются многие патогенные вирусы. При культивировании учитывается тропность вируса к определенной ткани. Наличие вируса в аллантоисной и амниотической жидкости зараженного эмбриона определяют в иммунологических реакциях.
Культивирование в культуре ткани. В настоящее время наибольшее практическое применение получили однослойные культуры первично-трипсинизированных и перевиваемых линий клеток. Источником получения клеток служат ткани эмбрионов, а также ткани, извлеченные у человека при операции. Чаще всего применяют культуры клеток, полученных из нормальных и раковых тканей организма. Широко используют линии клеток Hela, полученные из опухолей шейки матки; Hep-2, полученные из злокачественной опухоли гортани; КВ – из ткани рака полости рта.
Индикация вируса по цитопатическому (ЦПД) действию. ЦПД – это совокупность морфологических и функциональных изменений, происходящих в клетке под влиянием внутриклеточного вируса, приводящих к нарушению метаболизм клеток, прекращению синтеза НК, подавлению синтеза белка. Происходит освобождение и активация клеточных лизосомальных ферментов, которые вызывают деструкцию клеточных компонентов, то есть развитие ЦПД, что выражается в симпластообразовании, образовании включений, пикнозе ядра.
Индикация вируса по ЦПД. Проводят заражение исследуемым материалом однослойных культур (монослой клеток). Для этого просматривают под малым увеличением микроскопа сплошной клеточный слой
Индикация вируса в реакции гемадсорбции. Гемадсорбция – это способность культуры клеток, которая заражена вирусом, адсорбировать на своей поверхности эритроциты. Этот феномен связан со способностью встраиваться в мембрану зараженных вирусом клеток вирусспецифических белков-гемагглютининов, к которым присоединяются эритроциты за счет специальных рецепторов и адсорбируются на поверхности зараженных клеток.
Индикация вируса по цветной пробе. Цветная проба основана на регистрации изменения цвета среды, которая содержит фенолрот (индикатор) и помещенный в нее исследуемый материал. Если в материале есть вирус, он разрушает клетки монослоя и они становятся неспособнымы к метаболизму. Собственных систем метаболизма вирус не имеет, следовательно, кислых продуктов метаболизма не выделяет, и цвет питательной среды не меняется. Если в материале нет вируса, то клетки монослоя живут, функционируют, выделяют кислые продукты метаболизма, что приводит к изменению цвета среды, она приобретает желтый цвет.