Фармация, 2 курс, лекции биохимии / 4

ВОЕННО-МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

Экз №__

Кафедра клинической биохимии и лабораторной диагностики

«УТВЕРЖДАЮ»

ИО начальника кафедры

клинической биохимии и

лабораторной диагностики

полковник медицинской службы

В.ПАСТУШЕНКОВ

«___» _____________ 2008 г.

доцент кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики

доктор медицинских наук В.АНТОНОВ

_____________________________________________________________________

должность, ученая степень, ученое звание, воинское звание, инициал имени, фамилия автора (авторов)

ЛЕКЦИЯ № 4

по дисциплине: «Биохимия»

___________________________________________________________

(наименование учебной дисциплины)

на тему: «Биохимия простых и сложных белков. Структура и функция нуклеиновых кислот. Молекулярная биология гена. Генная инженерия»

________________________________________________

(наименование темы занятий по тематическому плану изучения дисциплины)

с курсантами и студентами 2 курса факультетов подготовки врачей

(военно-медицинских специалистов иностранных армий)

Обсуждена и одобрена на заседании кафедры

«____» ____________ 200___ г.

Протокол №______

Уточнено (дополнено):

«____» ____________ 200___ г.

_____________________________________

(воинское звание, подпись, инициал имени, фамилия)

Лекция на тему: «Биохимия простых и сложных белков. Структура и функция нуклеиновых кислот. Молекулярная биология гена. Генная инженерия»

Учебные групп: курсанты и слушатели II курса ФПВ

Цель лекции: Рассмотреть вопросы строения, функции, классификации простых и сложных белков, структуру и функцию нуклеиновых кислот. Молекулярные аспекты биологии гена. Дать представление о генной инженерии

Время лекции: 2 часа

План лекции.

Введение.

Классификация сложных белков, общая характеристика структуры и функции.

Нуклеиновые кислоты

Ген

Генная инженерия

Заключение

Введение

Простые белки построены только из аминокислот. Сложные белки построены из двух компонентов - простой белок и небелковое вещество, называемое простетической группой. Простетические группы прочно связаны с белковой частью молекулы.

Классификация сложных белков

Классификация сложных белков зависит от строения простетической группы.

Гликопротеины (содержат углеводы).

Липопротеины (содержат липиды).

Фосфопротеины (содержат фосфорную кислоту).

Хромопротеины (содержат окрашенную простетическую группу).

Металлопротеины (содержат ионы различных металлов).

Нуклеопротеины (содержат нуклеиновые кислоты).

Гликопротеины. Простетические группы этих белков представлены углеводами и их производными.

Гликопротеины содержат от 1 до 30 % углеводов, которые прочно связаны с белковой частью молекулы. Они представлены различными моносахаридами, их ацетил-амино-производными, дезоксисахаридами, нейраминовыми и сиаловыми кислотами. Они могут быть также представлены линейными или разветвленными олигосахаридами.

Функции гликопротеинов:

большинство белков на внешней поверхности животных клеток (рецепторы);

большая часть синтезируемых клеточных белков (интерфероны);

большая часть белков плазмы крови (кроме альбуминов):

иммуноглобулины;

групповые вещества крови;

фибриноген, протромбин;

гаптоглобин, трансферин;

церулоплазмин;

мембранные ферменты;

гормоны (гонадотропин, кортикотропин).

Связь между углеводными компонентами и белковой частью в гликопротеинах ковалентно-гликозидная, через ОН группы серина, треонина, или NH группу лизина, аспарагина, глутамина.

Липопротеины - сложные белки. Их простетическая группа представлена разнообразными липидами. Существует несколько классов липидов. Каждый из них выполняет специфическую биологическую функцию:

- структурную (например в составе цитоскелета);

- транспортную (например транспортные и плазменные липопротеины).

Фосфопротеины - сложные белки. Их простетическая группа представлена фосфорной кислотой. Остатки фосфата соединяются с белковой частью молекулы сложноэфирными связями через гидрокси-группы аминокислот серина и треонина.

К фосфопротеинам относятся казеины - белки молока, вителлины - яичного желтка, овальбумин - белок куриного яйца. Большое количество их содержится в ЦНС. Многие важные ферменты клетки активны только в фосфорилированной форме. Фосфопротеины являются источником энергетического и пластического материала.

Металлопротеины кроме белка содержат ионы одного или нескольких металлов. Ионы металлов соединены координационными связями с функциональными группами белка.

Пример металлопротеинов:

ферритин, трансферрин - Fe;

алкогольдегидрогеназа - Zn;

цитохромоксидаза - Cu;

протеиназы - Mg, К;

АТФ-аза - Na, К, Са, Мg.

Как правило, металлопротеины - ферменты. Ионы металлов выполняют следующие функции:

являются активным центром фермента;

служат мостиком между активным центром фермента и субстратом, сближают их;

служат акцепторами электронов на определенной стадии ферментативной реакции.

Нуклеопротеины - это сложные белки, небелковым компонентом которых являются нуклеиновые кислоты - ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) или РНК (рибонуклеиновая кислота).

Нуклеиновые кислоты

Молекулы нуклеиновых кислот заряжены отрицательно, поэтому они образуют с положительно заряженными белковыми компонентами ионные связи.

Нуклеиновые кислоты - линейные (реже - циклические) гетерополимеры, их мономерами являются мононуклеотиды. Мононуклеотид состоит из трех частей:

азотистого основания (у всех нуклеиновых кислот);

пентозы (рибозы у РНК или дезоксирибозы у ДНК) - вместе они составляют нуклеозид;

остатка фосфорной кислоты. Номенклатура различных мононуклеотидов представлена в таблице.

Номенклатура нуклеотидов.

Азотистое основание	Нуклеозид	Нуклеотид
Аденин	Аденозин	Аденозинмонофосфат (АМФ)
Гуанин	Гуанизин	Гуанизинмонофосфат (ГМФ)
Урацил	Уридин	Уридинмонофосфат (УМФ)
Тиамин	Тиамидин	Тиамидинмонофосфат (ТМФ)
Цитозин	Цитидин	Цитидинмонофосфат (ЦМФ)

Мономеры, из которых потом строятся нуклеиновые кислоты, состоят из азотистого основания, остатка сахара (дезоксирибоза или рибоза) и фосфата. Сахара вместе с азотистым основанием называются нуклеозидами (аденозин, гуанозин, тимидин, цитидин). Если к ним присоединены 1-, 2-, или 3-фосфорных остатка, то вся эта структура называется Соответственно, нуклеотизид монофосфатом, дифосфатом или трифосфатом или нуклеотидом (аденин, гуанин, тимин, цитозин).

Модель АТФ в плоскости и пространстве.

ТМФ встречается только в ДНК, а УМФ - только в РНК. Если в составе мононуклеотида имеется дезоксирибоза, то в начало его названия добавляется приставка "дезокси".

В составе нуклеиновых кислот мононуклеотиды связаны 3, 5-фосфодиэфирными связями между рибозами (дезоксирибозами) соседних мононуклеотидов через остаток фосфорной кислоты. Поэтому, если молекула нуклеиновой кислоты не является циклической, концы ее различны.

Один из них обозначается как 3-конец, а другой - 5-конец. Начальным считается 5-конец.

Первичная структура ДНК

Как любой полимер, молекула ДНК обладает пер­вичной структурой, образованной уникальной после­довательностью чередования 4 видов мономеров: азо­тистых оснований, 2 из которых являются пуринами, а 2 — пиримидинами, соединенными гомополимерной сахарофосфатной цепью. Фосфоэфирные связи после­довательно соединяют З'-атом углерода остатка дезоксирибозы каждого предыдущего нуклеотида с 5'-ато­мом углерода последующего, создавая непрерывный ковалентно-связанный остов молекулы. Последова­тельность азотистых оснований и является собственно генетической матрицей, на которой при помощи триплетного кода записана вся наследственная информация организма. Весьма условно можно провести аналогию между такого типа кодировкой и буквами алфавита, в определенной очередности образующих слова и фра­зы. Хотя в генетическом словаре всего четыре буквы, но их оказывается достаточно для шифрования после­довательности 20 различных аминокислот, из которых состоят все будущие белковые молекулы — конечные продукты функционирующих генов. Таким же обра­зом закодированы регуляторные участки генома -промоторы и энхансеры, старт- и стоп-кодоны и др.

Стабильность первичной структуры молекулы ДНК позволяет клеткам из поколения в поколение со­хранять уникальную для каждого организма наслед­ственную информацию (генотип). Изменения в после­довательности чередующихся азотистых оснований (мутации) могут приводить к возникновению ошибок в наследственной информации, различные возможные последствия которых описаны ниже.

Строго говоря, первичная структура ДНК, обладая значительным консерватизмом, все же не является по­стоянной. Открытие мобильных диспергированных генов, транспозонов показало, что отдельные участки молекулы способны перемещаться вдоль цепи в про­цессе нормального функционирования и дифференци-ровки клеток, меняя при этом первичную структуру молекулы. Особенно такие перестройки характерны для клеток лимфоидной ткани: с ними связана терми­нальная дифференцировка наивных лимфоцитов, при­водящая к появлению клонов узко специализирован­ных иммунокомпетентных клеток. Неслучайность таких участков и дискретность генетической информа­ции позволяют в ходе подобных перемещений сохра­нить целостность генома.

С другой стороны, некоторые вирусы (ретро-, аде­новирусы и др.) способны встраивать в ДНК-клетки хозяина дополнительные элементы, а также перетас­кивать участки генов или целые гены из одного локу-са молекулы ДНК в другие. Действие ионизирующей радиации, химических канцерогенов и мутагенов, ошибки в процессе репликации ДНК также приводят к изменениям в первичной структуре молекулы. Такие изменения носят, как правило, случайный характер и потому изменяют целостность генома и представля­ют собой соматические мутации. Последствия таких изменений не однозначны.

Если мутация возникла в «бессмысленном» участ­ке ДНК, она, как правило, носит безразличный харак­тер. Такой же характер имеют мутации, возникающие в конститутивно репрессированных генах. Понятие конститутивной репрессии тканеспецифично и связа­но с особенностями клеточной дифференцировки, в связи с чем ген, репрессированный в клетках опреде­ленного типа, может оказаться функционально значи­мым в клетках другого гистогенеза. К примеру, терми­нальная (унаследованная, т. е. присутствующая во всех клетках данного организма) мутация генов BRCA1/2 обусловливает чрезвычайно высокий риск раннего развития рака молочной железы или яичника, но никак не проявляется в клетках прочих тканей.

Если мутация затронула функционирующий ген, то ее последствия не могут носить безразличного ха­рактера, однако они и в этом случае не однозначны: при изменении последовательности оснований в регуляторных участках гена может наблюдаться как ослаб­ление его экспрессии вплоть до полного отключения (нокаут гена), так и аномальная активация (гипер- или , оверэкспрессия) вплоть до приобретения постоянной нерегулируемой активности. Наконец, мутация в «смысловой» части гена, кодирующей определенный белковый продукт (миссенс-мутация), может вызвать появление измененного белка. В свою очередь, измененный белковый продукт по функциональным свойствам может полностью соответствовать белку «дикого» типа: либо иметь сниженную специфическую ак-| тивность; либо, напротив, гиперактивность; либо, наконец, приобретать иной, не свойственный белку «дикого» типа, вид активности. Таким образом, в зависимости от совокупности многих факторов соматические мутации могут приво-I дить как к снижению жизнеспособности клетки, оста-I новке ее деления и гибели, так и, напротив, к ее усиленному росту и делению вплоть до опухолевой транс формации.

Вторичная структура ДНК

Вторичная структура ДНК представлена двойной спиралью, модель которой была открыта более полувека назад будущими Нобелевскими лауреатами (премия присуждена именно за это открытие) Джеймсом Уотсоном и Френсисом Криком. Согласно этой модели молекула нативной ДНК представляет собой две зеркально отраженные (в отношении комплементарных друг другу пуриновых и пиримидиновых азотистых оснований) антипараллельные (5'-конец одной цепи соседствует с 3'-концом другой) цепи, соединенные друг с другом силами комплементарного взаимодействия. Важнейшее свойство ДНК — избирательность в образовании связей (комплементарность).   Размеры оснований и двойной спирали подобраны в природе таким образом, что тимин (Т) образует водородные связи только с аденином (А), а цитозин (С) — только с гуанином (G) .

Водородные связи не являются ковалентными, а потому могут быть относительно легко разрушены, что приводит к расхождению обеих нитей — денатурации в молекулы.ДНК. Этот процесс (локальная денатурация) абсолютно необходим для выполнения молекулой ДНК матричных функций, а также репликации самой молекулы.

В составе 2-нитевой (2-цепочечной) молекулы обе нити ДНК являются правозакрученными спиралями с общей осью: азотистые основания обращены внутрь молекулы, образуя гидрофобную зону, а обе сахаро-фосфатные цепи расположены периферически (плектонемическая спираль). Хорошо известны несколько канонических форм двойной спирали, различающихся геометрическими размерами. Классическая В-форма, модель которой предложена Уотсоном и Криком в 1953 г., имеет следующие характеристики: один ви­ток правозакрученной молекулы содержит 10 пар нук-леотидов, длина его проекции на ось составляет 34 А (ангстрем), диаметр (по атомам фосфора) — 18 А; мо­лекула имеет большую и малую боковые бороздки с поперечником 17 и 11 А соответственно.

Три представления двунитевой молекулы ДНК:

а и б — классические изображения двуспиральной ДНК;

в — ДНК как двухцепочечная структура с неопре­деленными физическими параметрами, но с цепями, комплементарными друг другу;

А, С, G, Т — мономерные звенья полимерной мо­лекулы ДНК;

C-G, Т-А — комплементарные пары оснований, связывающие две цепи

Та­кая форма молекулы существует в препаратах, уровень влажности которых близок к физиологическому. При частичном обезвоживании ДНК переходит в А-форму, в которой один виток содержит уже 11 пар ос­нований, проекция витка на ось составляет 28 А, диа­метр уменьшается на 1 А, а ширина обеих бороздок сравнивается. С-форма, образующаяся в присутствии солей лития, напротив, является более рыхлой, чем В-форма: виток содержит 9 нуклеотидньгх пар. Абсолют­но уникальна открытая относительно недавно левоза-крученная Z-форма ДНК, содержащая 12 нуклеотидов на 1 виток. В пределах канонических форм воз­можно существование определенных промежуточных вариантов, переходы между которыми осуществляют­ся не кооперативно, в отличие от кооперативных пере­ходов от одной канонической формы к другой.

Конформационные переходы на отдельных участках гигантской молекулы ДНК важны для выс­ших уровней организации и функционирования хро­матина и будут обсуждаться в соответствующем раз-деле. Здесь же следует отметить, что наличие двой­ной спирали в любой из канонических форм возмож­но не только при участии 2 нитей, но и на отдельном участке 1-нитевой молекулы, однако при условии, что этот участок будет нести палиндромную после­довательность, т. е. симметрично отраженную после­довательность комплементарных оснований, напри­мер «...ATCAG...CTGAT...». В таком участке 2-нитевой молекулы ДНК может образовываться «шпилька» или «крест», представляющие собой сим­метричный дуплексный отросток, ось которого пер­пендикулярна основной оси молекулы. Обратимое образование «шпилек», «креста» и конформационные пе­реходы молекулы, играет определенную роль в регу­лировании активности отдельных генов.

Структуры ДНК высших порядков организации

В предыдущих разделах кратко описана структура собственно молекулы ДНК вне ее связи с другими компонентами хроматина. Все последующие уровни организации этого биополимера охватывают структу­ру супрамолекулярного комплекса ДНК.

В составе хроматина молекула ДНК находится во взаимодействии с большим количеством белков (мас­совое соотношение ДНК:белок в ядрах разных клеток различается, но в среднем близок к соотношению 1:1 — 1:2), которые делят на 2 неодинаковые группы гистоны и негистоновые белки хроматина. Гистоны (белки основного характера, растворимые в кислотах) составляют большую часть (до 80 %) суммарных ядер­ных белков, негистоновые белки (кислые, нейтраль­ные и некоторые слабо основные) составляют количе­ственно меньшую часть ядерных белков, но объединя­ют в своей группе значительно большее разнообразие структурных, ферментативных и регуляторных белко­вых компонентов хроматина.

Структура нуклеогистонового комплекса хорошо изучена и определяется 2 уровнями его организации: нуклеосомным и нуклеомерным. Нуклеосомы представляют собой нуклеопротеидные частицы диа­метром 10 нм, состоящие из центральной (коровой) белковой частицы с соленоидоподобной укладкой дву-нитевой молекулы ДНК на ее поверхности. Коровая частица является октамером 4 гистонов (у человека — гистоны Н2а, Н2Ь, НЗ и Н4), по 2 молекулы каждого на 1 частицу. Длина участка ДНК, непосредственно кон­тактирующая с коровой частицей, составляет 140 пар нуклеотидов (п.н.), что соответствует молекулярной массе (ММ) ок. 100 кДа. ДНК, контактирующая с ко-ровыми частицами, стерически защищена от действия эндонуклеаз. Молекула ДНК образует на поверхности коровой частицы 2 витка, после чего, не обрываясь, переходит на следующую коровую частицу. Длина свободного участка ДНК между соседними коровыми частицами (линкер) оценивается в 30-60 п.н. (10-20 нм). Морфологически нуклеосомный уровень орга­низации хроматина выглядит, как «бусинки на нитке».

Схема организации хроматина и N-i гистона НЗ человека (а), возможные сайты посттрансляционных модификаций гистонов НЗ и Н4 (б).

На поверхности нуклеосомы N-конец гистона Н и концы других гистонов, представлены в виде коне тивного домена; на схеме гистона НЗ отмечены мес: иболее распространенных посттрансляционных мо; каций: ацетилирование (флажок), фосфорилирован (кружок) и метилирование (шестиугольник), вполне можны и некоторые модификации в глобулярном до: Обращает на себя внимание пространственная per ность мест модификаций, звездочка указывает на тс Lys-9 может быть как ацетилирован, так и метилирован.

С линкером ассоциирован гистон HI, защающий свободный вненуклеосомный участок ДН действия эндонуклеаз и имеющий значение для фо рования следующего уровня организации хромати нуклеомеров, которые являются олигоме нуклеосом, образующими супербидную (от англ. i beads — большие шары) спираль. Нуклеомерная организация свойственна транскрипционно неактивному хроматину и обеспечивает его высокий уровень пактизации и защиты от нуклеазного расщепления.

Присутствие нуклеосом в промоторных участках генов препятствует образованию инициаторного ком­плекса транскрипции, в состав которого входят РНК-полимераза и факторы транскрипции, и для инициа­ции транскрипции необходимо локальное разрушение нуклеосомной структуры хроматина в окрестностях промотора и регуляторных элементов. При этом кон­ститутивно транскрибируемые гены вовсе не имеют нуклеосомной структуры в промоторной области.

Не вполне ясен механизм, посредством которого поддерживается непрерывное существование участка в виде свободной от нуклеосом последовательности ДНК: либо факторы транскрипции успевают провза-имодействовать с промоторным участком еще до сбор­ки нуклеосом, либо эти факторы связываются с соот­ветствующими участками ДНК, содержащими нуклео­сомы, и дестабилизируют последние. В пользу такого предположения свидетельствует способность коровых гистонов к многочисленным обратимым модификаци­ям: фосфорилированию, ацетилированию, метилиро­ванию — которые вызывают конформационные изме­нения молекул и соответственно изменение белок-бел­ковых взаимодействий. В частности, химическая модификация консервативных доменов гистонов НЗ и Н4 вызывает дестабилизацию корового октамера, ко­торый диссоциирует с освобождением 2 димеров Н2а/Н2Ь; димеры же НЗ/Н4 сохраняют связь с ДНК, но структурно не препятствуют прохождению репли-кативного или транскрипционного комплексов.

Таким образом, обратимая сборка-разборка нук­леосом является регуляторным элементом функцио­нальной активации генов, а хранение транскрипцион-но неактивного хроматина в форме супербидной спи­рали хромомеров предотвращает риск нуклеазного переваривания генетического материала.

; Значительно менее изучены взаимоотношения ДНК с негистоновыми белками хроматина. В первую очередь, это связано с огромным количеством негисто­новых белков, часть которых обладает видовой и тка­невой специфичностью. По данным двухмерного элек­трофореза, число негистоновых белков ядра превыша­ет 450, включая модифицированные формы, однако это количество учитывает только мажорные фракции, доступные визуализации при существующих методах неспецифического окрашивания электрофореграмм. учетом минорных белковых компонентов клеточно го ядра реальное количество негистоновых белков хроматина может измеряться тысячами.

До сих пор отсутствует единая классификация не­гистоновых белков, для их классификации используют прочность их связи с хроматином (экстрагируемость), физико-химические (растворимость, изоэлектричес-кая точка, молекулярная масса, подвижность при элек­трофорезе и др.), функциональные свойства, фермен­тативную активность.

Часто негистоновые белки классифицируют на ос­новании способа их выделения из препаратов тоталь­ного хроматина в растворах различной ионной силы и с содержанием разных диссоциирующих агентов. Так, до 10 % негистоновых белков может быть извле­чено из хроматина экстракцией 0,35 М NaCl (глобули-новая фракция хроматина); до 90 % негистоновых бел­ков удаляются обработкой ядер 2,0 М NaCl с 5 М мо­чевины или 37 %-ным раствором гуанидин-хлорида. Большая часть остаточных после такой экстракции белков может быть отделена додецилсульфатом натрия (SDS), 2-меркаптоэтанолом и щелочью. Однако и пос­ле такой обработки с ДНК остается связанной неболь­шое количество белка, который не удаляется даже при депротеинизации ДНК фенолом или хлороформом. Следовательно, взаимоотношения ДНК с разны­ми негистоновыми белками неравнозначны, и гово­рить о нативной структуре супрамолекулярного ком­плекса хроматина можно только с позиции сохранения интактности тех или иных взаимодействий в конкрет­ных препаратах изолированного хроматина.

Из всего многообра­зия негистоновых белков хроматина следует выделить компоненты ядерного матрикса (скелетной фибрил­лярно-гранулярной структуры ядра) и- небольшую группу обычно сопутствующих им белков (компонен­ты подмембранного фиброзного слоя ядра — ламины, белки ядерных пор и некоторые другие). Именно эти компоненты клеточного ядра образуют простран­ственную матрицу, на которой происходит регулируе­мое функционирование молекулы ДНК.

Ген — материальный носитель наследственной информации, совокупность которых родители передают потомкам. В настоящее время, в молекулярной биологии установлено, что гены — это участки ДНК, несущие какую-либо целостную информацию — о строении одной молекулы белка или одной молекулы РНК. Эти и другие функциональные молекулы определяют рост и функционирование организма.

В то же время, каждый ген характеризуется рядом специфических регуляторных последовательностей ДНК, таких как промоторы, которые принимают непосредственное участие в регулировании проявлением гена. Регуляторные последовательности могут находиться как в непосредственной близости от открытой рамки считывания, кодирующей белок, или начала последовательности РНК, как в случае с промоторами (так называемые cis-регуляторные элементы, англ. cis-regulatory elements), так и на расстоянии многих миллионов пар оснований (нуклеотидов), как в случае с энхансерами и супрессорами (иногда классифицируемые как trans-регуляторные элементы, англ. trans-regulatory elements). Таким образом, понятие гена не ограничено только кодирующим участком ДНК, а представляет собой более широкую концепцию, включающую в себя и регуляторные последовательности.

Изначально термин ген появился как теоретическая единица передачи дискретной наследственной информации. История биологии помнит споры о том, какие молекулы могут являться носителями наследственной информации. Большинство исследователей считали, что такими носителями могут быть только белки, так как их строение (20 аминокислот) позволяет создать больше вариантов, чем строение ДНК, которое составлено всего из четырёх видов нуклеотидов. Позже было экспериментально доказано, что именно ДНК включает в себя наследственную информацию, что было выражено в виде центральной догмы молекулярной биологии.