Патология, связанная с усилением апоптоза

Одной из групп заболеваний, связанных с усилением апоптоза, являются патологии системы крови. Чаще всего патологические процессы развиваются в результате гибели посредством апоптоза костномозговых клеток-предшественников. Причиной их гибели является недостаточность факторов выживания. Данный тип патологии приводит к развитию апластической анемии; анемии при дефиците железа, фолатов, витамина B₁₂; талассемии; тромбоцитопении; лимфопении; нейтропении; панцитопении. Повышенная готовность к развитию апоптоза Т-лимфоцитов обнаружена при мультицентрической болезни Кастелмана.

Прогрессия некоторых инфекционных заболеваний может быть связана не только с подавлением, но и наоборот, с усилением апоптоза. Индукторами программируемой клеточной гибели при этом служат бактериальные эндо- и экзотоксины. Массовый апоптоз развивается при сепсисе. Гибель лимфоцитов путём апоптоза находится в положительной корреляции с быстрой прогрессией СПИДа.

Отдельную группу патологии составляют заболевания нервной системы, обусловленные атрофией определённых участков нервной ткани в результате апоптоза. Примерами таких заболеваний могут служить боковой амиотрофический склероз, болезнь Альцгеймера, спинальная мышечная атрофия и др.

Апоптоз является преобладающей формой гибели миоцитов в ранний период развития инфаркта. На основе экспериментальных данных было выявлено, что программируемая гибель кардиомиоцитов может быть обусловлена гипоксией, ишемией, перегрузкой клетки кальцием, воспалением, токсинами. В процессе токсического (в том числе и алкогольного) гепатита основная роль также отводится апоптозу.

Ряд патологических процессов, обусловленных усилением апоптоза, индуцируется внешними апоптогенными факторами. Апоптоз прогрессирует под воздействием ионизирующей радиации. При этом преимущественно гибнут лимфоидные клетки, и развивается иммунная недостаточность. Аналогичный эффект дают многие химиотерапевтические препараты, используемые при лечении опухолей, а также гормоны, применяемые при лечении различных заболеваний.

4.2. Использование молекулярно-генетических маркеров в биологических исследованиях

ДНК-маркеры (или молекулярно-генетические маркеры) – это полиморфныйпризнак, выявляемый методамимолекулярной биологиина уровненуклеотиднойпоследовательностиДНК, для определенногогенаили для любого другого участкахромосомыпри сравнении различных генотипов, особей, пород, сортов, линий и т.д. За последние годы накопился большой массив данных об эффективности использования молекулярно-генетических маркеров, как на уровне белков, так иДНК,РНК, для решения многих задач генетики, селекции, сохранения биоразнообразия, изучения механизмов эволюции, картирования хромосом, а также для семеноводства и племенного дела.

4.2.1. Основные типы молекулярно-генетических маркеров

Наиболее широко используемые молекулярно-генетические маркеры условно можно подразделить на следующие типы - маркеры участков структурных генов, кодирующих аминокислотные последовательности белков (электрофоретические варианты белков), маркеры некодирующих участков структурных генов и маркеры различных последовательностей ДНК, отношение которых к структурным генам, как правило, неизвестно - распределение коротких повторов по геному (RAPD - случайно амплифицируемая полиморфная ДНК; ISSR - инвертированные повторы; AFLP – полиморфизм в сайтахрестрикции) имикросателлитныелокусы (тандемные повторыс длиной элементарной единицы в 2-6 нуклеотидов). Имеется целый набор современных технологий выявления полиморфизма на уровне ДНК, среди которых можно выделить следующие:

• анализ полиморфизма длин рестриктныхфрагментов ДНК (ПДРФ или RFLP);

• анализ полиморфизма с помощью Полимеразной Цепной Реакции(ПЦР): RAPD, ISSR, AFLP, SSR и другие методы на основе амплификации ДНК междуповторяющимися последовательностямив геномной ДНК, как IRAP, REMAP и iPBS.

4.2.2. Метод полимеразной цепной реакции(ПЦР)

Применение метода ПЦР предполагает использование специфических праймерови получение дискретных ДНК-продуктов амплификации отдельных участков геномной ДНК. Большое количество родственных технологий построено на этом принципе. Наиболее широко используемая RAPD технология основана на анализе амплифицированных полиморфных фрагментов ДНК с помощью единичных праймеров с произвольной нуклеотидной последовательностью.

ПЦР — это экспериментальный метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе).

Помимо амплификацииДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введениемутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, дляклонированиягенов, выделения новыхгенови т.д.

История открытия ПЦР

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была изобретена в 1983 году американским биохимиком Кэри Муллисом. Его целью было создание метода, который бы позволиламплифицироватьДНК в ходе многократных последовательныхудвоенийисходной молекулы ДНК с помощью ферментаДНК-полимеразы. Первая публикация по методу ПЦР появилась в ноябре 1985 года в журнале Science. Через 8 лет после этого, за изобретение метода ПЦР, К.Муллис получилНобелевскую премию.

В начале использования метода после каждого цикла нагревания — охлаждения приходилось добавлять в реакционную смесь ДНК-полимеразу, так как она инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК. Процедура проведения реакции была сравнительно неэффективной, требовала много времени и фермента. В1986 годуметод полимеразной цепной реакции был существенно улучшен. Было предложено использовать ДНК-полимеразы из термофильных бактерий. Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать множество циклов реакции. Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерийThermus aquaticus и названа Taq-полимеразой. Недостаток этой полимеразы заключается в том, что вероятность внесения ошибочного нуклеотида у неё достаточно высока, так как у этого фермента отсутствуют механизмы исправления ошибок (3'→5' экзонуклеазнаяактивность). Полимеразы Pfu и Pwo, выделенные изархей, обладают таким механизмом, их использование значительно уменьшает число мутаций в ДНК, но скорость их работы (процессивность) ниже, чем у Taq. Сейчас применяют смеси Taq и Pfu, чтобы добиться одновременно высокой скорости полимеризации и высокой точности копирования.