Генетическая инженерия 16.09.14

Генная пушка PIG (Particle Inflow Gun), конструкции Д.Файнера и др.

Сотрудники лаборатории проф. Д.Файнера (1993 г.)

Вустер, Огайо, США

L-R Back: John Finer, Tai-Sheng Cheng, Masood Hadi, Hong-Chang Ma Front: Cheri Nemes, Alex Gaponenko, Philippe Vain, Barb Norris

PIG в секторе клеточной инженерии растений института биологии развития им.Н.К.Кольцова РАН

Основные этапы генетической трансформации и получения

генетически модифицированного (генно-инженерного или биотехнологического) растения

1.Индукция морфогенного каллуса или прямой регенерации клеточной структуры, компетентной к прямой регенерации растения in vitro.

2.Создание векторных конструкций для доставки и регуляции экспрессии генов

«интереса» в клетку-мишень, компетентную к регенерации в растение.

3.Встраивание чужеродных генов в геном реципиента – посредством агробактериальной трансформации или прямого ввода генов via биобаллистики.

4. Селективный отбор трансформированных клеток. Введение наряду с геном

«интереса» селективного гена для негативной - (устойчивость к антибиотикам

– гены hyg, nptII) или позитивной селекции – (способность усваивать продукт – ген PMI фосфоманозаизомераза).

5.Индукция регенерации побегов или эмбриогенеза in vitro.

6.Укоренение или прививка побегов.

7.Адаптация пробирочных растений к условиям теплицы.

8.Молекулярный – ПСР и саузерн анализы на предмет интеграции в геном и определение числа копий введенного гена.

9.Отбор трансформантов с высокой экспрессией трансгена и с наименьшими отклонениями от исходного фенотипа.

10.UPOF – полевые испытания и испытания на биобезопасность.

Индукция морфогенного каллуса, выбор экспланта

или клеточной структуры, компетентной к прямой регенерации растения in vitro.

Bombardment

Селективный отбор трансформированных клеток, на среде с селективным агентом

Индукция регенерации побегов или эмбриогенеза in vitro.

Укоренение или прививка побегов

Молекулярный – ПСР, RT-PCR и Cаузерн, Вестерн анализы на предмет интеграции в геном и определение числа копий введенного гена.

Нами исследованы параметры баллистической трансформации, влияющие на эффективность трансформации

Физические параметры

Физические и химические свойства металлических частиц используемых для переноса ДНК (размер, хим. инертность)

Природа ДНК (концентрация, размер молекул), преципитация ДНК на частицы

Давление и обьем Не при выстреле

Величина отрицательного давления вакуума в камере

Расстояние от источника частиц до ткани-мишени

Количество выстрелов на один образец ткани

Биологические параметры

Выбор типа и возраста экспланта

Обработка ткани-мишени осмотическим шоком до и после бомбардмента

Стратегия селекции трансгенных тканей

Отложенная

Градационная

Регенерационная

Векторные конструкции, созданные на основе вектора psGFPBAR, с Gly I and GST генами, которые любезно предоставлены проф. S. K.Sopory (ICGEB, New-Delhi).

Общая схема ведения культуры клеток пшеницы и регенерации растений in vitro

Незрелый зародыш, 1 -1,5 мм