Генетическая инженерия 16.09.14
.pdf
В процессе генетической трансформации растительной клетки можно выделить десять главных событий:
Источник: Tzvi Tzfira and Vitaly Citovsky, Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants: biology and
biotechnology, CURRENT OPINION IN BIOTECHNOLOGY 2006, 17:147–154.
1.Процесс начинается с распознания агробактерией специфических рецепторов клетки хозяина и прикрепления бактерии к клетке хозяина (растения-реципиента), посредством белков, кодируемых хромосомой агробактерии;
2.Опознавание специфических сигналов растительной клетки двух компонентной системой агробактерии (VirA–VirG) сигнально – трансдукцион ного механизма;
3.Далее следует VirG-mediated сигнальная трансдукция и активация вирулентных (vir) генов в vir области агробактерии;
4.Образование мобильной копии T-DNA, the T-strand;
5.Доставка VirD2–DNA комплекса (незрелый T-комплекс), вместе с несколькими другими Vir белками, в цитоплазму клетки растения реципиента;
6.После ассоциации VirE2 с T-strand, и образования зрелого T-комплекса, последний импортируется через цитоплазму хозяина;
7.T-комплекс активно импортируется
вовнутрь ядра клетки растенияхозяина;
8.Оказавшись внутри ядра, the T-DNA доставляется в место интеграции геномной ДНК;
9.T-DNA освобождается от эскортирующих ее белков.
10.Наступает момент интеграция T-DNA в геном клетки хозяина посредством VirD2 и/или VirE2 и факторов хозяина.
Проф. А.К.Гапоненко |
51 |
Типы агробактериальных векторов для генетической трансформации растений
Коинтегративный вектор |
Бинарный вектор |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Бинарные векторные системы, создание которых Отсутствуют заключается в том, что агробактериальная клетка должна
содержать по крайней мере две разные модифицированные Ti-плазмиды. Одна из них должна содержать только virобласть, гены которой будут участвовать в вырезании Т-ДНК. Такие плазмиды называют плазмидами-помощницами. Вторая Ti-плазмида должна содержать область Т-ДНК с
нужным встроенным геном. Продукты vir-генов способны Гены vir 
вырезать Т-ДНК как на собственной плазмиде, так и на соседней, то есть vir-гены могут работать вне зависимости от их местоположения. Таким образом, если клетки агробактерии содержат Ti-плазмиду с сегментом vir и другую плазмиду с Т-ДНК, несущей встроенный ген, эти бактерии могут трансформировать клетки растений.
Бинарные векторы CAMBIA
Маркерный ген
Селективный ген
Селективный ген
Обязательными элементами бинарного вектора являются:
• Сайт инициации репликации широкого круга хозяев, либо два репликатора, функционирующих в E. Coli
иA.tumafaciens;
•Правую и левую фланкирующую последовательность Т-ДНК;
•Полилинкер (множественный сайт клонирования) для встраивания/инсерции гена (генов) между границами Т-ДНК;
•Ген, обеспечивающий селекцию трансформантов бактерий, содержащих данный вектор;
•Целевую кодирующую последовательность, для переноса в растения.
Проф. А.К.Гапоненко |
53 |
Маркерные гены, для отслеживания процессов трансформации и экспрессии в трансгенных клетках, тканях и растениях
Проф. А.К.Гапоненко |
54 |
|
Маркерные гены: ген люцефиразы luc
Проф. А.К.Гапоненко |
55 |
Маркерные гены β-глюкоронидаза - uidA
A B
Мониторинг транзиентной экспрессии гена
β-глюкоронидазы uidA, при биобаллистической трансформации
подсолнечника: A – незрелых зародышах, B – семядолях подсолнечника.
(Гапоненко, 1993 )
Проф. А.К.Гапоненко |
56 |
Маркерные гены β-глюкоронидаза - uidA
Мониторинг стабильной экспрессии гена
β-глюкоронидазы uidA при агробактериальной трансформации подсолнечника (Гапоненко, 1993 )
Проф. А.К.Гапоненко |
57 |
|
Экспрессия маркерного гена гена β-глюкоронидазы - uidA в трансгенном подсолнечнике:
A – разрез незрелого соцветия; B – цветках и развивающихся семенах;
C – прорастающих семенах T1 (2ой генерации) и D – различных тканях растения.
A B
D C
(Гапоненко, 1997 )
Проф. А.К.Гапоненко |
58 |
Экспрессия маркерного гена гена β-глюкоронидазы - uidA в трансгенном
подсолнечнике: A – разрез незрелого соцветия;
B – специфическая экспрессия гена uidA в пыльцевых нитях.
A B
(Гапоненко, 1997)
Проф. А.К.Гапоненко |
59 |
Маркерные гены: Green Fluorescent Protein - GFP
Мониторинг транзиентной экспрессии гена gfp в незрелых зародышах и каллусных тканях пшеницы после биобаллистики
а |
б |
в |
г |
(а) Транзиентная экспрессия гена gfp в незрелом зародыше пшеницы
(б, в) Транзиентная экспрессия гена gfp в каллусных тканях через 24 часа после биобаллистической трансформации; (г) контроль не трансформированный каллус (Фадеев, Гапоненко, 2006)
Проф. А.К.Гапоненко |
60 |