Генетическая инженерия 16.09.14
.pdf
Основные этапы генных манипуляций
клонирование гена интереса
|
|
|
|
Проф. А.К.Гапоненко |
41 |
||
ЭРА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ РАСТЕНИЙ НАЧАЛАСЬ 18 ЯНВАРЯ 1983 ГОДА НА СИМПОЗИУМЕ В МАЙАМИ, США
(MIAMI WINTER SYMPOSIUM)
Мари-Делл Хилтон, Университет штата Вашингтон, Сиэтл, США, доложила о получении растений табака, устойчивых к антибиотику канамицину.
Джеф Шелл и Марк ван Монтегю, университет Гент, Бельгия, сообщили о создании растений табака, устойчивых к канамицину и метатриоксату,
Роберт Фралей и Роберт Хорч, компании Монсанто, Сант-Льюса, штат Миссури, США, получили растения петунии устойчивые к канамицину.
Во время одной сессии, Джефф Шелл, Роб Horsch от Monsanto, и я доложили об исследованиях Agrobacterium и ее адаптации как вектора для трансформации растений.
Все т рое сообщили, об успехе химерного гена устойчивост и к канамицину в качестве селективного маркера для растительных клеток.
БЫЛО ЯСНО, ЧТО ПРОГРЕСС, ПОЛУЧЕННЫЙ ВО ВСЕХ ТРЕХ ГРУППАХ, ДЕЛАЕТ РЕАЛЬНОСТЬЮ УЛУЧШЕНИЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ КУЛЬТУР
МЕТОДАМИ ГЕННОЙ ИНЖЕНЕРИИ.
Mary-Dell Chilton
Plant Physiology, January 2001, Vol. 125, pp. 9–14, www.plantphysiol.org © 2001 American Society of Plant Physiologists
Проф. А.К.Гапоненко |
42 |
42
Основатели генетической инженерии растений:
Мари Дел- |
Джеф |
|
Шелл, |
||
Хильтон, |
||
2005: «В конце-концов |
Первая его статья, |
|
трансформирующая |
написанная в |
|
бактерия, какое бы ни |
соавторстве с |
|
имя ей не было, всего |
Марком Ван |
|
лишь маленький |
Монтегю, о ДНК |
|
кусочек технологии |
Agrobacterium |
|
необхо-димой для |
опубликована в 1972 |
|
создания трансгенного |
и посвящена фагам |
|
растений». |
Agrobacterium. |
|
|
Марк Ван Монтегю
Решение Шелла изучать как Agrobacterium tumefaciens, почвенная бактерия вызывает опухоли у растений, явилась ключом к тому прогрессу, который мы достигли за последние 30 лет
Тимоти Холл
|
Dr. Timothy C. Hall |
|
Distinguished Professor |
|
of Biology |
|
Director, Institute of |
|
Developmental and |
|
Molecular Biology |
|
Texas A&M University |
Dr. Robert T. Fraley |
Robert Horsch |
Executive Vice President and |
Апрель 1983 года, ген запасного белка фасоли |
Chief Technology Officer |
успешно экспрессировались в клетках |
|
подсолнечника, после переноса его посредством |
|
плазмиды агробактерии. |
Проф. А.К.Гапоненко |
43 |
Agrobacterium tumefaciens - бактерия и «корончатые галлы» - болезнь которую она вызывает
Цитируется по Проф.Vitaly Citovsky
Проф. А.К.Гапоненко |
44 44 |
Генная инженерия в природе.
Заболевание «корончатых галл» растений известно с времен Аристотеля. В 1907 году Е.Смит и К.Таудсен показали, что это заболевание вызывает почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens
Общая схема «генетической колонизации» (Shell et al.,1983) Agrobacterium tumefaciens растения и образование опухоли.
Проф. А.К.Гапоненко |
45 45 |
Схема строения Agrobacterium tumefaciens и
генетическая карта Ti плазмиды (Tumor inducing) – вызывающая опухоли.
•T-DNA (transferred DNA) – ДНК, переносимая в ядро клетки растения
•Л и П – левая и правая границы Т-области (right и left borders, RB и LB) с прямыми повторами длиной 25 пн
•Область, содержащая vir-гены, контролирует синтез и перенос Т-ДНК в растения
•Область оri – точка начала репликации
Проф. А.К.Гапоненко |
46 |
Список «Разоруженных» линий агробактерии», лишенных генов аналогов фитогормонов – ауксинов и цитокининов, вызывающих образование опухолей в растениях
Проф. А.К.Гапоненко |
47 |
Общая схема генетической карты Ti плазмиды (Tumor inducing) – вызывающей опухоли.
T- DNA, – transferred
– переносимая ДНК
Размеры Т-ДНК Ti и Ri плазмид варьируют от 10 до 30 kbp
ДНК Ti-ПЛАЗМИДЫ МОЖНО ИСПОЛЬЗОВАТЬ В КАЧЕСТВЕ ВЕКТОРА
Т-ДНК Ti-плазмид обладает двумя свойствами, делающими ее по существу идеальным вектором для введения чужеродных генов в клетки растений. Во-первых, круг хозяев агробактерий очень широк: они трансформируют клетки практически всех двудольных растений. Известно, что можно добиться заражения однодольных, в том числе злаков. Во-вторых, интегрированная в состав генома растения Т-ДНК наследуется как простой доминантный признак в соответствии с законами Менделя, а ее гены имеют собственные промоторы (регуляторная область гена, определяющая время и место его экспрессии), под контролем которых могут экспрессироваться вставленные в Т-ДНК чужеродные гены
Проф. А.К.Гапоненко |
48 |
Как встраивать нужные гены в Т-сегмент ДНК плазмиды.
1.Прежде всего Т-сегмент вырезают из Ti-плазмиды с помощью рестриктаз и встраивают в один из стандартных плазмидных векторов для размножения в клетках бактерий - Escherichia coli.
2.E. сoli содержит плазмиду pBR322, которая способна к саморепликации, то есть размножению, приводящему к увеличению числа ее копий. После того как в плазмиду pBR322 внедрили участок Ti-плазмиды, это рекомбинантная структура может затем реплицироваться многократно, что приводит к увеличению числа копий участков Ti-плазмиды. Этот процесс называется клонированием.
3.Бактерии, содержащие плазмиду pBR322 с участком Т-ДНК, размножают, после чего эту плазмиду выделяют. Затем с использованием рестриктаз и стандартных приемов работы с рекомбинантной ДНК в Т-сегмент встраивают определенный ген.
4.Этот молекулярный гибрид, теперь уже содержащий Т-ДНК со встроенным в нее геном, снова размножают в E. сoli, а затем вводят в клетки A. Tumefaciens. Таким образом, мы получаем клетки A. tumefaciens, несущие Ti-плазмиду со встроенным в Т-сегмент нужным геном.
Схема трансформационной кассеты
СОДЕРЖИТ:
1.Ген интереса
•Кодирующая последовательность
иее контролирующие элементы
2.Селективный ген - маркер
•для отличия трансформированное/ нетрансформированное растение
3.Инсерционные последовательности агробактерии (25 пар нуклеотидов с каждого конца)
•Agrobacterium insertion
Проф. А.К.Гапоненко |
50 |