004 lec bio
.pdf
Технология рекомбинантных ДНК (рДНК)
Этапы генетического конструирования in vitro:
1. Получение нужного гена (выделение нужных генов из ДНК, химико-
ферментативный синтез, ферментативный синтез гена на основе выделенной мРНК);
2.Встраивание полученного гена в генетический элемент, способный к репликации (вектор), например, получение рекомбинантной плазмиды;
3.Введение гена в составе вектора (например, рекомбинантной плазмиды) в организм-реципиент, например в клетки E.coli (конъюгация, трансформация, трансдукция);
4.Клонирование в E.coli фрагмента ДНК;
5.Идентификацию (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели нужный ген или гены.
6.Полученные гибридные ДНК подвергают дальнейшим перестройкам и затем вводят в реципиентные клетки, изменяя их генотип и фенотип.
51
Ферменты, позволяющие получать рекомбинантные молекулы ДНК
Высокоспецифичные ферменты, способные узнавать и расщеплять (гидролизовать) ДНК в строго определенном месте, называются рестрикционными эндонуклеазами или рестриктазами.
схема действия фермента рестриктазы EcoRI
схема действия фермента рестриктазы SmaI
52
Некоторые рестриктазы и расщепляемые ими последовательности
Для устранения разрыва после рекомбинации фрагментов ДНК используют другой фермент -- ДНК-лигазу, катализирующий образование фосфодиэфирных связей между концами полинуклеотидных цепей, которые удерживаются вместе водородными
связями при соединении липких концов. |
53 |
|
Векторы для экспрессии и клонирования
Требования, предъявляемые к векторам:
•Способность реплицироваться в клетке-хозяина (содержат ori -- точку начала репликации);
•Способность включать чужеродные ДНК различной молекулярной массы без нарушения способности к репликации;
•Легкость введения в клетку-хозяина;
•Наличие генетического маркера селекции, обеспечивающего быструю селекцию клеток, содержащих вектор;
•Наличие только 1 сайта рестрикции для каждой рестриктазы.
•Легко извлекаются из клеток хозяина
Плазмидные векторы
Внехромосомные двуспиральные малые молекулы ДНК, длиной в 1-200 тысяч пар нуклеотидов автономно размножающиеся в клетке, называются плазмидами. Размеры плазмид варьируют от менее 1 до более 500 т.п.н. С помощью плазмидных векторов можно клонировать
фрагменты ДНК длиной до 10 т.п.н.
54
Генетическая карта плазмиды pBR322 (41 т.п.н.)
Плазмида несет гены устойчивости к двум антибиотикам:
ампициллину (ген bla) и тетрациклину (ген tet), а также уникальные сайты для BamHI, EcoRV и SalI в
гене Теt, один PstI-сайт в гене Bla, один сайт для EcoRI, находящийся за пределами кодирующих последовательностей, и сигнал начала репликации, обеспечивающий репликацию исключительно в Е.coli.
55
Получение кДНК для клонирования
56