696

другому антибиотику. Таким образом, вектор дает возможность детектировать только те клоны бактерий, которые содержат рекомбинантную плазмиду.

Таким образом, требования, предъявляемые к векторам, включают: 1. Способность реплицироваться в клетке-хозяина; 2. Способность включать чужеродные ДНК различной молекулярной массы без нарушения способности к репликации; 3. Легкость введения в клеткухозяина; 4. Наличие генетического маркера селекции, обеспечивающего быструю селекцию клеток, содержащих вектор; 5. Наличие только 1 сайта рестрикции для каждой рестриктазы.

Бактериофаг в качестве вектора

С помощью плазмидных векторов можно клонировать фрагменты ДНК длиной до 10 т.п.н. Для клонирования более крупных фрагментов были разработаны векторы на основе бактериофага . Этот фаг является умеренным фагом E.coli К-12, содержащим двухцепочечную ДНК размером 48500 п.н. с одноцепочечными 5’-«хвостами» из 12 нуклеотидов. Их называют липкими (cos) концами.

Примерно у 30% фаговых частиц ДНК интегрируется с бактериальной хромосомой и реплицируется вместе с ней (состояние

лизогении, см. раздел 3.2).

За способность к лизогении отвечает фрагмент около 20 т.п.н. Если этот фрагмент заменить фрагментом другой ДНК (кодирующей целевой белок), образующаяся рекомбинантная молекула будет реплицироваться в клетке как ДНК «рекомбинантного» фага , вставшего на литический путь развития.

Рис.19. Строение бактериофага

62

фазы. Сокращению лаг-фазы способствует идентичность состава питательной среды инокулята и промышленного процесса, а главное – объем инокулята должен составлять 10-15% объема промышленного культивирования.

Проблема продления экспоненциальной, самой продуктивной, фазы роста является и самой трудной. Здесь важно не допустить исчерпания питательных веществ и своевременно удалять ингибирующие рост продукты метаболизма.

3.3.4. Бактерии как продуценты в биотехнологии

Бактерии являются важнейшими продуцентами в биотехнологии. С помощью бактерий получают вино, молочные продукты, закваски и другие пищевые продукты, ацетон и бутанол, этанол, уксусную и лимонную кислоты, витамины, ряд ферментов, антибиотики и каротиноиды. Бактерии участвуют в трансформации стероидных гормонов. Их используют для получения белка и ряда аминокислот. Применение бактерий для переработки отходов в биогаз или этанол даёт возможность создания принципиально новых возобновляемых энергетических ресурсов. Бактерии используют для извлечения металлов (в т.ч. золота), увеличения нефтеотдачи пластов. Благодаря бактериям и плазмидам стало возможным развитие генетической инженерии. Изучение бактерий сыграло огромную роль в становлении многих направлений биологии, в медицине, агрономии и др. Велико их значение в развитии генетики, т.к. они стали классическом объектом для изучения природы генов и механизмов их действия. С бактериями связано установление путей метаболизма различных соединений и др.

Потенциал бактерий в практическом отношении неисчерпаем. Углубление знаний об их жизнедеятельности открывает новые направления эффективного использования бактерий в биотехнологии и других отраслях промышленности.

31

Производственные штаммы микроорганизмов должны соответствовать определенным требованиям: способность к росту на дешевых питательных средах, высокая скорость роста и образования целевого продукта, минимальное образование побочных продуктов, стабильность продуцента в отношении производственных свойств, безвредность продуцента и целевого продукта для человека и окружающей среды. В связи с этим все микроорганизмы, используемые в промышленности проходят длительные испытания на безвредность для людей, животных и окружающей среды. Важным свойством продуцента является устойчивость к инфекции, что важно для поддержания стерильности, и фагоустойчивость – устойчивость к заражению бактериофагами. Примеры использования бактерий в биотехнологии приведены в Табл.2.

Таблица 2 Бактерии – продуценты важнейших биотехнологических

продуктов

последовательностей, и сигнал начала репликации, обеспечивающий репликацию исключительно в Е.coli. Плазмидный вектор pBR322 в 80-е годы был одним из самых популярных универсальных векторов. Обычно обозначение плазмидного вектора включает строчную букву «р» (от англ, plasmid) и еще несколько букв, имеющих отношение к описанию вектора или к истории его создания. Так, буквы BR в обозначении плазмиды pBR322 указывают на авторство Ф. Боливара и Р. Родригеса, сконструировавших эту плазмиду, а число 322

— цифровое обозначение, взятое из их исследовательских протоколов. Длина плазмиды pBR322 — 41 т.п.н.

Рис.18. Генетическая карта плазмиды pBR322.

Если фрагмент чужеродной ДНК встраивается в один из генов устойчивости, то последний инактивируется. Следовательно, успешное встраивание фрагмента чужеродной ДНК в один из этих генов легко детектировать по исчезновению у бактерий устойчивости к данному антибиотику. Но при этом сохраняется устойчивость к

61

соединении липких концов. ДНК-лигаза сшивает и тупые концы.

3.Векторы для экспрессии и клонирования.

Вкачестве векторов, способных переносить в клетку-реципиент генетическую информацию, чаще используют плазмиды и бактериофаги.

Плазмидные векторы

Внехромосомные двуспиральные малые молекулы ДНК, длиной в 1-200 тысяч пар нуклеотидов автономно размножающиеся в клетке, называются плазмидами. Плазмиды, как правило, присутствуют у бактерий и являются кольцевыми молекулами, хотя у некоторых растений и грибов известны линейные плазмиды. Плазмиды выполняют разнообразные функции. Одни из них содержат информацию, обеспечивающую их собственный перенос из одной клетки в другую (F- плазмиды), другие несут гены устойчивости к антибиотикам (R-плазмиды) или специфические наборы генов, ответственных за утилизацию необычных метаболитов (плазмиды деградации). Есть плазмиды, в которых не обнаружены гены, выполняющие какие-то определенные функции (криптические плазмиды; от англ, cryptic - скрытый, латентный). Размеры плазмид варьируют от менее 1 до более 500 т.п.н. Каждая из них содержит сайт начала репликации ORI, без которого репликация плазмиды в клетке-хозяине была бы невозможна.

На Рис. представлена генетическая карта плазмиды рВR322. Это одна из наиболее часто употребляемых плазмид для клонирования. pBR322 создана на основе плазмид природного происхождения, выделенных из E. coli. Эта плазмида несет гены устойчивости к двум антибиотикам: ампициллину (ген bla) и тетрациклину (ген tet), а также уникальные сайты для BamHI, Hind III и SalI в генеТеtг, один PstI-сайт в гене Атрг, один сайт для EcoRI, находящийся за пределами кодирующих

60

3.4. ЭУКАРИОТЫ

Эукарио́ты, или Я́дерные(лат. Eucaryota от греч. εύ- - хорошо и κάρυον - ядро) - надцарство живых организмов, клетки которых содержат ядра (см. Рис.2). Все организмы, кроме вирусов и бактерий, являются ядерными. В ядре содержится генетическая информация (ДНК) и осуществляются процессы репликации (удвоение молекул ДНК), транскрипции (синтез молекул РНК на матрице ДНК) и процессинг РНК с образованием мРНК (см. раздел

34

Первая прописная буква в обозначении рестриктазы соответствует первой букве названия рода, а последующие две или три строчные буквы берутся из первых букв названия вида этого микроорганизма. Далее может приводиться название штамма и, наконец, римская цифра обозначает порядковый номер фермента, отражающий хронологию его выделения из данного организма. Несколько рестриктаз и их сайты узнавания представлены в таблице 6.

Таблица 6. Некоторые рестриктазы и расщепляемые ими

последовательности.

Для устранения разрыва после рекомбинации фрагментов ДНК используют другой фермент - ДНКлигазу, катализирующий образование фосфодиэфирных связей между концами полинуклеотидных цепей, которые удерживаются вместе водородными связями при

59

Рис. 16. а) схема действия фермента рестриктазы SmaI на двухцепочечную молекулу ДНК, с указанием участка распознавания и места разреза; б) фрагменты ДНК с тупыми концами после разрезания ферментом SmaI.

Рис. 17. а) схема действия фермента рестриктазы EcoRI на двухцепочечную молекулу ДНК, с указанием участка распознавания и места разреза; б) фрагменты ДНК с липкими концами после разрезания ферментом EcoRI.

Скрепить выступающие липкие концы двух молекул ДНК помогает другой фермент - ДНК-лигаза. Он лигирует, то есть “сшивает“ между собой сахарофосфатные остовы двух фрагментов с образованием полной структуры двойной спирали ДНК. Внешне она ничем не отличается от обычной ДНК. Сейчас в арсенале генных инженеров имеется более 500 различных рестриктаз, способных разрезать ДНК примерно в 120 различных местах.

Номенклатура рестриктаз базируется на названии микроорганизма, из которого она была впервые выделена.

58

4.2.1). В специальном образовании внутри ядра – ядрышкепроисходит синтез рибосомальной РНК (рРНК).

Животные, растения, грибы, а также группы организмов под общим названием протисты (простейшие) - все являются эукариотическими организмами. Они аэробны, могут быть одноклеточными и многоклеточными, но все имеют общее строение клеток. В отличие от клеток бактерий у эукариотов в клетках присутствуют органеллы, отделенные от цитоплазмы одной или двумя мембранами. К двумембранным органеллам относятся митохондрии и пластиды, а также клеточное ядро. Одна мембрана ограничивает эндоплазматический ретикулум (ЭР), комплекс Гольджи, лизосомы. Такое выраженное подразделение цитоплазмы на множество обособленных пространств называется компартментализацией. Ряд клеточных органелл (рибосомы, центриоли) не окружены мембранами.

Митохондрии – важнейшие органеллы, в которых осуществляется окисление органических веществ до диоксида углерода и воды и аккумулирование выделяющейся энергии в виде АТФ. У растений также присутствуют пластиды, например хлоропласты - пластиды зелёного цвета, содержащие хлорофилл. В хлоропластах происходит фотосинтез.

Эндоплазматический ретикулум образует в цитоплазме каналы, по которым осуществляется транспорт веществ. ЭР, примыкающий к ядру, покрыт рибосомами, белковонуклеиновыми комплексами, в которых осуществляется синтез мембранных белков, и называется шероховатым. ЭР без рибосом называют гладким.

Лизосомы – контейнеры с гидролитическими ферментами, пероксисомы – контейнеры с ферментом каталазой, разрушающей пероксид водорода.

35

Рис.13. Строение типичной клетки животного. Отмеченные органеллы: 1. Ядрышко 2. Ядро 3. Рибосома 4. Везикула 5. Шероховатый эндоплазматический ретикулум 6. Аппарат Гольджи 7. Клеточная стенка 8. Гладкий эндоплазматический ретикулум 9. Митохондрия 10. Вакуоль 11. Гиалоплазма 12. Лизосома 13. Центросома (Центриоль)

Аппарат Гольджи – органеллы в виде стопки сплющенных цистерн, от которых отделяются пузырьки и перемещаются к внешней мембране и сливаются с ней (экзоцитоз). Аппарат Гольджи (комплекс Гольджи) — мембранная структура эукариотической клетки, органелла, в основном предназначенная для выведения веществ, синтезированных в эндоплазматическом ретикулуме. Аппарат Гольджи был назван так в честь итальянского учёного Камилло Гольджи, впервые обнаружившего его в

1898 году.

В цитоплазме эукариот содержится цитоскелет – система длинных полых структур, придающий клеткам форму, служит местом прикрепления органелл.

Сравнение про- и эукариотов представлено в Табл.3.

36

мРНК определяет аминокислотную последовательность синтезируемого белка. Функцию узнавания кодона осуществляет не сама аминокислота, а молекула транспортной РНК (тРНК), к которой она присоединена и которая содержит последовательность нуклеотидов, комплементарную кодону – антикодон.

2. Ферменты, позволяющие получать рекомбинантные молекулы ДНК.

Высокоспецифичные ферменты, способные узнавать и расщеплять ДНК в строго определенном месте, называются рестрикционными эндонуклеазами или

рестриктазами.

Рестриктазы распознают в молекулах ДНК очень короткие, но строго специфичные для каждого фермента участки длиной в 4 – 6 пар нуклеотидов (сайты узнавания) и разрезают обе цепи ДНК посередине этих участков или с некоторым смещением. В первом случае образуются фрагменты с ровными (тупыми) концами (рис.16), а во втором – стороны разрезаемых цепочек ДНК заходят одна за другую. Такие одноцепочечные концы называются "липкими", поскольку они могут как бы слипаться между собой в силу комплементарности. Примером рестриктазы второго типа является EcoRI, которая узнает фрагмент ДНК из шести нуклеотидов ГААТТЦ, и режет эту последовательность ДНК ассиметрично между нуклеотидами Г и А (рис.17). В результате место разреза в одной цепи смещено по отношению к другой на 4 пары оснований. При таком разрезе образуется два выступающих конца. Эти концы соединяются водородными связями. Если с той же EcoR1 получить фрагменты ДНК из различных организмов, то все они будут иметь одинаковые, подходящие друг к другу “липкие концы” (рис.17).

57

инициации определяется специальными регуляторными участками ДНК – промоторами. Терминация синтеза также происходит на специальных участках ДНК – терминаторах. В клетках бактерий РНК синтезируется сразу в зрелом виде

– в виде мРНК (матричная РНК), а у эукариотов – в виде предшественника мРНК, который должен подвергнуться процессингу – ферментативным превращениям, в результате которых образуется зрелая мРНК. Процессинг включает кэпирование (присоединение к 5’-концевому метилированному звену предшественника мРНК 7- метилгуанозина), полиаденилирование (присоединение к 3’-концу сегмента поли(А)), сплайсинг РНК (вырезание интронов и соединение экзонов – кодирующих последовательностей – в непрерывную последовательность).

Трансляция (мРНК белок) – многоступенчатый процесс синтеза белка согласно информации, заключенной в последовательности нуклеотидов мРНК. Трансляция осуществляется на клеточных органоидах - рибосомах, которые представляют собой нуклеопротеиды, в составе которых рибосомальная РНК (рРНК) и белок. При инициации происходит специфическое связывание рибосомы с мРНК и с первой аминоацил-тРНК, в результате чего образуется комплекс, способный к синтезу белка. При элонгации осуществляется последовательное связывание аминоацил-тРНК с образованием пептидных связей по программе, задаваемой последовательностью кодонов в мРНК. Терминация представляет собой отщепление готового белка от трансляционного комплекса. В ходе трансляции нуклеотидная последовательность мРНК считывается в направлении от 5’- к 3’-концу. Считывание происходит по законам генетического кода, согласно которым каждой аминокислоте соответствует триплет нуклеотидов (кодон), каждый кодон кодирует только одну аминокислоту, а последовательность кодонов

56

Таблица 3

Сравнение прокариотов и эукариотов

3.4.1. Грибы

Грибы́(лат. Fungi или Mycota) — особая форма жизни, царство живой природы, объединяющее эукариотические организмы, сочетающие в себе некоторые признаки как растений, так и животных. Они играют важную роль в биосфере, разлагая всевозможные органические материалы. Грибы – важнейшие продуценты в биотехнологии.

Изучение грибов – это предмет науки микологии. Грибы относятся к эукариотам, они растут в аэробных условиях и получают энергию путем окисления органических веществ, как и животные. Также они имеют клеточную оболочку, состоящую из хитина. С растениями их сближает ряд общих признаков: наличие клеточной стенки и вакуолей, заполненных клеточным соком, апикальный рост, хорошо видимое под микроскопом

37

движение протоплазмы, неспособность к активному перемещению. В отличие от растений грибы не способны к фотосинтезу и слабо дифференцированы морфологически, у них почти нет разделения функций между разными частями организма.

3.4.1.1.Строение и классификация грибов

Кгрибам относятся истинные слизевики (миксомицеты), низшие грибы (фикомицеты) и высшие грибы (собственно грибы или эумицеты) (Табл.3).Тело гриба состоит из тонких (диаметром около 5 мкм) нитей, называемых гифами, которые, переплетаясь, образуют мицелий. В зависимости от строения гифов грибы подразделяют на низшие и высшие (Рис.14).

Рис.14. Вегетативные гифы грибов: А –у фикомицетов гифы несептированные(не имеют поперечных перегородок); Б – септированные гифы эумицетов; В – у оомицетов гифы

разделены неполными перетяжками.

Гифы грибов растут путем удлинения кончиков (апикальный рост). Различают два способа размножения грибов – половое и бесполое. Большинство грибов размножаются обоими способами. Бесполое размножение осуществляется обычно при помощи спор, путем почкования или фрагментации. Наиболее широко распространено спорообразование. На концах гиф отшнуровываются конидиоспоры и дают начало новому организму.

38

был создан арсенал приемов и методов, позволяющих производить рекомбинацию генов in vitro, затем вводить полученную генную конструкцию в клетку, при этом в последней синтезируются продукты введенных генов.

Фундаментальной базой генной инженерии явились открытые ранее механизмы экспрессии генов, внехромосомные молекулы ДНК – плазмиды, ферменты, позволяющие проводить рекомбинацию генов.

1.Молекулярные механизмы матричного синтеза.

Подробно механизмы матричного синтеза (репликации, транскрипции и трансляции рассматриваются в курсе «Основы биохимии»). Здесь мы коротко приведем основные положения.

Процесс удвоения молекулы ДНК называется репликацией ДНК (ДНК ДНК). Репликация осуществляется полуконсервативным путем на каждой из двух родительских цепей. Фермент - ДНК-зависимая ДНКполимераза – синтезирует нить ДНК, комплементарную родительской цепи (называемой матрицей), последовательно присоединяя к 3’-концу растущей цепи дезоксирибонуклеотиды, комплементарные дезоксирибонуклеотидам матрицы. В процессе репликации родительская двухцепочечная ДНК расплетается, образуя репликативную вилку. Для того, чтобы ДНК-полимераза могла начать синтез, необходимо существование готового фрагмента ДНК или РНК, комплементарного матрице и содержащего свободную 3’-ОН-группу. Этот фрагмент называют затравкой (праймером).

Процесс биосинтеза РНК в клетке называется транскрипцией ДНК (ДНК РНК). Транскрипция осуществляется ферментами ДНК-зависимыми РНКполимеразами, которые используют ДНК в качестве матрицы. Цепь РНК растет в направлении 5’ 3’. В отличие от ДНК-полимераз, РНК-полимеразы способны к самостоятельной инициации синтеза РНК. Место

55

Половое размножение у грибов включает слияние двух ядер, образование зиготы и мейоз или редукционное деление, при котором число хромосом уменьшается до исходного (гаплоидного).

Наибольшее значение для биотехнологии имеют одноклеточные грибы – дрожжи и мицелярные – плесневые грибы.

3.4.1.2. Дрожжи Дрожжи - внетаксономическая группа

одноклеточных грибов, утративших мицелиальное строение в связи с переходом к обитанию в жидких и полужидких, богатых органическими веществами субстратах. Объединяет около 1500 видов, относящихся к аскомицетам и базидиомицетам.

Дрожжи относятся к царству грибов (Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes), наилучшие углеводные субстраты для них – сахароза, глюкоза. Дрожжи встречаются в природе всюду, где есть поддающиеся сбраживанию сахаристые соки – на фруктах, на листьях, цветках, содержатся в почве, водоемах, пищеварительном тракте человека. Большинство дрожжей – сапрофиты, но встречаются и патогенные или условно патогенные формы, например, возбудитель кандидомикоза человека из рода

Candida.

Для дрожжей характерно бесполое размножение почкованием. При этом на материнской клетке образуется выпуклость – почка, в которую переходит 1 ядро, после чего почка отшнуровывается.

Дрожжи рода Saccharomyces способны к спиртовому брожению – в отсутствии кислорода они используют органические вещества в качестве акцепторов электронов и продуцируют этанол. В качестве источников углерода сахаромицеты утилизируют простые сахара, поэтому для использования доступных субстратов –

40

страже чистоты и стабильности своего генома, преодолеть практически невозможно.

Альтернативой классической селекции в получении организмов с заданными свойствами является генетическая инженерия, предмет которой - рекомбинация хромосом или отдельных генов вне организма, в пробирке (in vitro). Таким образом, преодолеваются все ограничения, с которыми сталкиваются селекционеры. Первые удачные эксперименты такого рода сделаны в 1972 году, и вскоре был создан арсенал приемов и методов, позволяющих производить рекомбинацию генов in vitro.

Возможности генетической инженерии:

1.Можно скрещивать индивидуальные гены видов, стоящих на разных ступенях эволюции.

2.Можно управлять процессом рекомбинации, так как он происходит в пробирке и не защищен запрещающими механизмами организма.

3.Можно предсказать результат, т.к. отбирается потомство одной молекулы ДНК (молекулярное клонирование).

Прежде, чем перейти к изучению основных методов генетической инженерии, целесообразно рассмотреть общие принципы процесса и специальную терминологию.

4.2.1.Теоретические предпосылки генетической инженерии

4.2.1.1. Термины и определения

Ген – структурная единица наследственности – участок ДНК, кодирующий структуру определенного белка или РНК.

Репликон - единица генома , способная к автономной репликации ДНК ; содержит точку инициации репликации. Экспрессия генов — это процесс, в котором наследственная информация от гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт — РНК или белок.

Транскриптон – участок ДНК, подвергающийся

53