696

Издание учебное

Пшеничникова Анна Борисовна

Основы биотехнологии

Учебное пособие

Подписано в печать_______ Формат 60х84/16. Бумага писчая. Отпечатано на ризографе. Уч. изд. листов 1.

Тираж 200 экз. Заказ № ____________

Московская государственная академия тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова.

Издательско-полиграфический центр.

119571 Москва, пр. Вернадского 86.

92

Министерство образования и науки Российской Федерации

Московская государственная академия тонкой химической технологии

им. М.В. Ломоносова

Кафедра Биотехнологии и бионанотехнологии

А.Б. Пшеничникова

ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ

Учебное пособие

Москва 2010

Для того чтобы извлечь из потенциала микроорганизмов все наиболее ценное, используют методы воздействия на геном, существенно расширяющие их производственные возможности – селекцию и мутагенез, а также генетическую инженерию.

4.1. ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ МЕТОДАМИ СЕЛЕКЦИИ

Традиционно для получения более активных биологических агентов – продуцентов - применяли селекцию и мутагенез. Селекция – это направленный отбор мутантов – организмов, наследственность которых приобрела скачкообразное изменение в результате структурной модификации в нуклеотидной последовательности ДНК. Генеральный путь селекции – это путь от слепого отбора нужных продуцентов к сознательному конструированию их генома. Традиционные методы отбора в свое время сыграли важную роль в развитии различных технологий с использованием микроорганизмов. Были отобраны штаммы пивных, винных, пекарских, уксуснокислых и др. микроорганизмов.

Для изменения природных способностей микроорганизмов используют изменения генотипа - мутации, приводящие к усилению природных способностей микроорганизмов синтезировать и продуцировать нужные вещества, а также синтезировать вещество в избытке – сверх своих потребностей и продуцировать его. Мутации, способствующие сверхсинтезу продукта, могут затрагивать большое число структурных генов, кодирующих ферменты всех этапов синтеза, транспорта и катаболизма данного продукта, а также регуляторные гены. Результат таких мутаций может проявиться в следующих основных изменениях метаболизма клеток:

1)повышение скорости поглощения и утилизации субстрата;

49

СОДЕРЖАНИЕ Стр.

1.ВВЕДЕНИЕ………………………………………………5

2.ПРЕДМЕТ И СОДЕРЖАНИЕ КУРСА…………………6

3.БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОБЪЕКТЫ………………………...9

3.1.КЛАССИФИКАЦИЯ ЖИВЫХ ОРГАНИЗМОВ....9

3.2.ВИРУСЫ…………………………………………...12

3.3.БАКТЕРИИ………………………………………...16

3.3.1.Таксономия бактерий……………………..17

3.3.2.Генетическая изменчивость бактерий...…22

3.3.3.Рост бактерий……………………………...26

3.3.4.Бактерии как продуценты в

биотехнологии…………………………………....31

3.4.ЭУКАРИОТЫ…...…………………………………34

3.4.1.Грибы………………………………………37

3.4.1.1.Строение и классификация грибов….38

3.4.1.2.Дрожжи………………………………..40

3.4.1.3.Мицелиальные грибы…………...……42

3.4.2.Простейшие………………………………...42

3.4.3.Растения …………………………………....43

3.4.4.Животные…………………………………..45

4.ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ ДЛЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ………………48

4.1.ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ МЕТОДАМИ СЕЛЕКЦИИ……………………...………………………….49

4.2.ПОЛУЧЕНИЕ ПРОДУЦЕНТОВ МЕТОДАМИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНЖЕНЕРИИ…………………...……52

4.2.1.Теоретические предпосылки генетической инженерии…………………………………………………...53

4.2.1.1.Термины и определения………………53

4.2.1.2.Важнейшие достижения молекулярной биологии……………………………………………………..54

4.2.2.Технология рекомбинантных ДНК ……….65

4.2.2.1.Получение генов, кодирующих целевые белки…………………………………………………………66

4.2.2.2.Встраивание полученного гена в вектор

3

11.Какие организмы относят к микроорганизмам? Их преимущества при использовании в качестве продуцентов в биотехнологическом процессе?

12.Чем занимается наука систематика (таксономия)?

13.Перечислите основные различия между прокариотами и эукариотами. Подробно объясните различия, касающиеся а) формы клеток, б) локализации генетического материала.

14.Классификация микроорганизмов по способам питания (по трофике). Приведите примеры.

15.Способы питания животных и растений. Чем они отличаются?

16.Цели и принципы культивирования дифференцированных клеток человека и животных in vitro.

17.Систематика (таксономия) микроорганизмов. Систематические категории.

18.Что такое систематика (таксономия) микроорганизмов? С помощью каких признаков описываются таксономические категории?

19.Биотехнологическое производство, его преимущества перед традиционными технологическими процессами?

20.Общие структурные компоненты клетки.

21.Строение животной и растительной клеток. Общее и различия. Какие органеллы этих клеток имеют двойные мембраны?

22.Классификация бактерий по Берги.

23.Окраска по Граму и строение клеточной стенки бактерий.

24.Селекция и генетическая инженерия, определения.

25.Вирусы. Живые ли они? (если «да» или «нет», то почему?). Их место в классификации всех организмов по царствам и надцарствам.

88

1. ВВЕДЕНИЕ

Дисциплина «Основы биотехнологии» является первым шагом на пути познания новой области науки – Биотехнологии. Эта новая современная междисциплинарная область связывает биологию и химическую технологию, биохимию и инженерные науки. Синтез биологических и химических наук расширяет возможности промышленной технологии для получения жизненно важных продуктов – препаратов для медицины, пищевых продуктов, биотоплива, экологических технологий. Знания биотехнологии необходимы также специалистам, работающим в области химии полимеров, основного органического и нефтехимического синтеза и других областях химической технологии, поскольку возможности живых систем могут усилить достижения отдельных химических технологий. Создавая новую технологию, современный специалист химик-технолог обязан учитывать возможности живых систем, заложенные природой, для усовершенствования технологий получения самых разных продуктов.

Базовыми знаниями, без которых невозможно освоение курса «Основы биотехнологии» являются знания органической химии, химии биологически активных веществ, биохимии, общей химической технологии, процессов и аппаратов химической технологии.

Настоящее учебное пособие «Основы биотехнологии» базируется на материале предшествующей дисциплины «Основы биохимии», восполняет отсутствующие у студентов 4 курса знания по микробиологии и дает всю необходимую терминологическую базу для освоения ключевого раздела биотехнологии – генетической инженерии.

5

2. ПРЕДМЕТ И СОДЕРЖАНИЕ КУРСА

Биотехнология (от греческих слов bios – жизнь, teken – искусство, logos – слово, учение, наука) – область науки и практики, основанная на направленном использовании биологических объектов для получения полезных продуктов. Объектами биотехнологии являются вирусы, бактерии, грибы, простейшие организмы, клетки (ткани) растений, животных и человека и их метаболиты, в частности биополимеры – ферменты, нуклеиновые кислоты и др.

Термин «биотехнология» был введен в 1917 г. венгерским инженером Карлом Эреки при описании процесса крупномасштабного выращивания свиней с использованием в качестве корма сахарной свеклы. По определению Эреки, биотехнология – это «все виды работ, при которых из сырьевых материалов с помощью живых организмов производятся те или иные продукты». Только в 1961 г. к термину «биотехнология» вновь вернулись после того как шведский микробиолог Карл Герен Хеден порекомендовал изменить название научного журнала

«Journal of Microbiological and Biochemical Engineering and Technology» (Журнал микробиологической и химической инженерии и технологии), специализирующегося на публикации работ по прикладной микробиологии и промышленной ферментации, на «Biotechnology and Bioengineering» (Биотехнология и биоинженерия). С этого момента биотехнология оказалась четко и необратимо связана с исследованиями в области «промышленного производства товаров и услуг при участии живых организмов, биологических систем и процессов».

Согласно определению Европейской биотехнологической федерации, созданной в 1978 г., биотехнология на основе применения знаний и методов биохимии, микробиологии, генетики и химической технологии позволяет получать необходимые продукты с

6

сельского хозяйства и др.) используются схемы производства различной степени сложности, при этом учитывают и место накопления целевого продукта – внутриклеточно, в биомассе или внеклеточно – в культуральной жидкости.

При локализации продукта в биомассе для ее выделения применяют такие методы, как седиментацию и декантацию, фильтрование, центрифугирование, отстаивание, флотацию. Если целевым продуктом является внеклеточный метаболит, его выделяют из культуральной жидкости методами экстракции, сорбции, осаждения, хроматографии, с применением мембранных методов – ультрафильтрации, диализа, обратного осмоса.

6.ВОПРОСЫ ДЛЯ ПОДГОТОВКИ К ЗАЧЕТУ

1.На какие науки опирается, и по каким направлениям развивается биотехнология?

2.Основные цели и задачи биотехнологии.

3.Какие методы используют биотехнологи для достижения целей и задач биотехнологии?

4.Отличие биотехнологии от традиционной химической технологии.

5.Объекты (продуценты) биотехнологических исследований.

6.Биотехнологический процесс и его компоненты.

7.Основные этапы биотехнологического производственного процесса.

8.Приведите примеры наиболее часто используемых в биотехнологических производствах микроорганизмов-продуцентов. Какие продукты с их помощью получают?

9.Классификация живых организмов по царствам и надцарствам.

10.Какие организмы-эукариоты относят к микроорганизмам?

87

Рис.1. Основные продукты биотехнологической промышленности.

Рис.31. Ферментер периодического действия: 1- турбинная трехъярусная мешалка, 2 – охлаждающий змеевик, 3 - секционная рубашка, 4 – отражательная перегородка, 5 – барботер, П-пар; I –XI – материальные и вспомогательные трубопроводы с запорно-регулирующими устройствами (I

– посевная линия, II – подача стерильного сжатого воздуха, III – подача пара, IV – удаление отработанного воздуха, V – загрузочная линия, VI – линия введения добавок, VII – подача пеногасителя, VIII – подача моющего раствора, IX – пробоотборник, X – выдача продукта, XI – выдача в канализацию через нижний спуск).

www.mitht.ru/e-library

продуктом является сама биомасса, в других случаях продукты, синтезируемые клеткой - антибиотики, ферменты, аминокислоты и др. При этом синтезируемый продукт может накапливаться как внутри клеток, так и выделяться в культуральную жидкость.

В том случае, когда культура растет на поверхности жидкой или плотной питательной среды, такой способ культивирования называют поверхностным.

При жидкофазном (глубинном) культивировании, микроорганизмы распределяются по всему объекту жидкой питательной среды, а кислород поступает к клеткам в результате интенсивной аэрации и перемешивания.

Аппараты для глубинного культивирования называют ферментерами (ферментаторами), конструкции их очень разнообразны. На Рис.31 представлен ферментер для периодического культивирования – питательная среда и все компоненты загружаются сразу и до окончания культивирования в ферментер ничего не добавляется и не выводится (кроме воздуха – источника кислорода). Его конструкция обеспечивает стерильность ферментации в течение длительного времени (несколько суток) при оптимальных условиях для роста и жизнедеятельности продуцента. Ферментеры такой конструкции изготавливают объемом от 1,25 до 160,0 м3. Как видно из рисунка, это цилиндрический вертикальный аппарат со сферическим днищем, снабженный аэрирующим, перемешивающим и теплопередающим устройствами. Воздух для аэрации поступает в ферментер через барботер, установленный под нижним ярусом мешалки.

Пустой аппарат тщательно моют, проверяют герметичность стерильность и стерилизуют острым паром. Одновременно стерилизуют все коммуникации. Затем в реактор подают стерильную питательную среду, вносят посевной материал, включают систему аэрации и перемешивающее устройство.

84

3.БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОБЪЕКТЫ

3.1.КЛАССИФИКАЦИЯ ЖИВЫХ

ОРГАНИЗМОВ

Классификация живых организмов (распределение единиц по группам более высокого порядка) осуществляется по иерархической схеме. Организмы объединяют в группы разного ранга – таксоны – группы организмов, обладающих заданной степенью однородности. Низшей единицей является вид, виды объединяются в роды, далее – семейства, отряды, классы, типы, царства, надцарства (таксоны наивысшего ранга). Разделение живых организмов по царствам и надцарствам основано на наличии у них ядра и клеточного строения (Рис.2). Выделено три надцарства: акариоты (безъядерные, клеточное строение отсутствует), прокариоты (доядерные, присутствует предшественник ядра – нуклеоид, клеточное строение) и эукариоты (ядерные, клеточное строение).

Рис.2. Классификация живых организмов по царствам и надцарствам.

В систематике (систематика – наука о многообразии и взаимосвязях между организмами)

используют биномиальную номенклатуру К. Линнея:

биологическому виду присваивают название на латинском языке, состоящее из двух слов: первое определяет принадлежность организма к определенному роду, второе

— виду. Пример – кишечная палочка Escherichia coli (обитает в кишечнике человека и животных), родовое

9

название можно сократить до первой буквы – E. coli. В микробиологии используют термин «штамм», объединяющие культуры вирусов, бактерий и других микроорганизмов и линий клеток растений и животных одного вида, выделенные из разных источников (мест обитания). Различия между штаммами не выходят за пределы вида. В мире не существует общепризнанной номенклатуры названия штаммов, и используемые названия достаточно произвольны. Как правило, они состоят из отдельных букв и цифр, которые записываются после видового названия. Например, один из самых известных штаммов кишечной палочки – E. coli K-12.

Представители всех царств используются в биотехнологии, являются биологическими объектами. Традиционная биотехнология базировалась на использовании микроорганизмов. Микроорганизмы – это биологические объекты микроскопического размера, невидимые невооруженным глазом. Термин «микроорганизмы» не имеет таксономического значения, представители микромира есть во всех царствах. Вирусы, бактерии и грибы – все являются микроорганизмами, в царстве растений микроорганизмами являются водоросли, а в царстве животных – простейшие. Основным преимуществом микроорганизмов является их быстрый рост, связанный с высоким отношением поверхности клетки к объему, т.е. с высокой скоростью взаимодействия с внешней средой.

Отличительной особенностью микроорганизмов является способность к быстрому размножению. Например, время удвоения клеток кишечной палочки Escherichia coli составляет 20 мин. Подсчитано, что потомство одной клетки в случае неограниченного роста уже через 48 ч превысило бы массу Земли в 150 раз.

Современная биотехнология все чаще рассматривает в качестве биологических объектов не

10

герметизация аппаратов, коммуникаций, арматуры. Основным методом очистки и стерилизации воздуха, огромные объемы которого используют в процессе ферментации, является пропускание через фильтры – стерилизующая фильтрация. Для стерилизации жидких питательных сред и оборудования чаще применяют термическую стерилизацию. Большие перспективы для стерилизации жидких питательных сред имеет микрофильтрация. Также применяют химическую деконтаминацию и ионизирующее излучение, когда другие методы не могут быть использованы.

Для стерилизации оборудования применяют

термическую стерилизацию паром под давлением 1 ати

(121оС).

Подготовка инокулята

Для сокращения лаг-фазы (непродуктивной фазы задержки роста, см. раздел 3.3.3) количество посевного материала, передаваемого в основной ферментер, может варьировать в разных производствах от 5 до 20% объема среды культивирования в нем. Накопление производственной культуры проводят за 2 - 6 этапов. Для этого используется ряд так называемых посевных аппаратов, рабочий объем которых каждый раз увеличивается, как правило, в 10 раз. Размер посевных аппаратов для разных производств различен и может варьировать от 10 л до 50 м3

Ферментация

Культивирование (ферментация) является основной стадией биотехнологического процесса и во многом определяет количественные и качественные характеристики производства продуктов. На стадии культивирования осуществляется накопление как самой биомассы, так и продуктов метаболизма (жизнедеятельности) микроорганизмов. Иногда, например, при производстве бактериальных препаратов, целевым

83