10. Зональное ( скоростоное) ценрифугування в градієнті щільності.

Зональное (скоростное) центрифугирование в градиенте плотности является одним из самых совершенных методов препаративной техники вирусологических исследований. Принцип метода состоит в том, что компоненты смеси, различающиеся по скорости седиментации, перемещаются под действием центробежной силы в центрифужной пробирке через непрерывный градиент концентрации. С целью приготовления градиентов концентрации чаще всего применяют сахарозу. Градиент концентрации сахарозы препятствует конвекции и стабилизирует зоны частиц.

В условиях градиента концентрации сахарозы определенную роль может играть плавучая плотность молекул. Это означает, что частицы с плавучей плотностью, близкой или равной плотности растворителя, будут двигаться медленнее или не будут седиментировать вообще, в отличие от частиц с такой же молекулярной массы и формы, но с большей плотностью.

При фракционировании этим методом смесей белков, нуклеиновых кислот и многих вирусов разделение основано главным образом на различиях в величине скорости седиментации молекул, а не на величине плавучей плотности. Это обусловлено тем, что плотность молекул нуклеиновых кислот, а также большинства вирусов значительно выше плотности самых концентрированных растворов сахарозы, поэтому при длительном центрифугировании все они не достигнут положения равновесия, а осядут на дно центрифужной пробирки. С другой стороны, при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы можно фракционировать по плотности смеси, содержащие частицы с меньшей величиной плавучей плотности (вирусы с в состав которых входят липиды).

При очистке большинства простых (т. е. состоящих только из белковой оболочки и нуклеиновой кислоты) вирусов применяют 10—40%-ные сахарозные градиенты.

Раствор, содержащий вирус, осторожно наслаивают на поверхность градиента. Центрифугирование проводят в роторах со свободно подвешенными стаканами в режиме 25 -65 тыс об./мин , 1,5-2 ч при 4^оС.

Зоны вируса можно увидеть при освещении сверху (они интенсивно рассеивают свет) и отобрать через верх пробирки шприцем с иглой, изогнутой под прямым углом недалеко от конца, прокалывая пробирку сбоку или фракционированием через дно пробирки. Возможно использование и более сложных приспособлений, например прибора для фракционирования градиентов фирмы Isco, в котором раствор вытесняется снизу вверх и проходит через спектрофотометрическую кювету для регистрации оптической плотности. Сахарозу можно удалить диализом против подходящего буферного раствора или осаждением вируса ПЭГ.

11. Изопикическое центрифугування. Визначення плавучой щільності віріонів.

Изопикническое центрифугирование для очистки вирусов проводят обычно в растворах хлористого или сернокислого цезия. Центрифугирование раствора в течение длительного времени приводит к установлению равновесия, при котором концентрация растворенного вещества возрастает в направлении от оси вращения и создает, таким образом (в сочетании с увеличивающимся давлением), градиент плотности. Равновесие обуславливается тем, что в каждой точке сумма центробежных, центростремительных сил и сил, вызывающих тепловое движение молекул (диффузия), становится равной нулю. Давление, возникающее в центрифужной пробирке, не приводит к перераспределению соли. Если в градиенте плотности центрифугировать макромолекулы, концентрация которых значительно ниже концентрации соли, используемой для создания градиента, то каждая молекула займет в градиенте положение, соответствующее ее плавучей плотности. Этот параметр макромолекулы определяется как плотность раствора, с которым молекула находится в равновесии.

Изопикнические градиенты получают центрифугированием в роторе SW40 при 36 000 об/мин или SW50 при 40 000 об/мин в течение 12 - 96 ч. Лучший результат достигается при центрифугировании в угловых роторах, а не в бакет-роторах.

Зоны вируса обнаруживают при освещении пробирки сверху и извлекают шприцем, проколов пробирку сбоку. Соли цезия затем удаляют диализом.

Для определения плавучей плотности частиц дно центрифужной пробирки прокалывают с помощью специального приспособления, и поток жидкости, движимый насосом, протекает через микрокювету спектрофотометра, одновременно устройство, соединенное со спектрофотометром, вычерчивает кривую поглощения УФ-лучей различными зонами градиента. Вытекающий из проточной кюветы спектрофотометра раствор можно собрать по объему на фракции. Присутствие вируса во фракции обнаруживают по инфекционности. Измерив коэффициент преломления в нескольких фракциях, рассчитывают плотность солевого раствора в каждой фракции по специальной формуле

ρ²⁵=а n²⁵ – b,

где коэффициенты преломления при 25^оС, а и б коэффициенты, различные для хлористого цезия и сульфата цезия.

Далее строят график зависимости плотности солевого раствора от глубины центрифужной пробирки или номера фракции. Паралельно располагают график зависимости активности вируса. Плавучая плотность вирусной смеси определяется как плотность солевого раствора в содержащей этот компонент фракции.