20. Культивирование аэробных и анаэробных микроорганизмов.

Чистые культуры – потомство одной клетки (клон). Чистая культура характеризуется однородностью клеток и колоний. Признаки, которые проявляет культура на жидких и твердых средах, называются культуральными.

Методы выделения чистых культур были предложены Р. Кохом в XIX в. Смешанные культуры – это потомство клеток 2-х или нескольких видов. Естественные популяции, как правило, представляют собой смесь различных микроорганизмов.

Смешанные культуры также могут быть приготовлены путем объединения чистых культур.

Накопительные культуры. Накопительными называют такие культуры, в которых преобладают представители одной группы или даже одного вида микроорганизмов. Для накопления нужны такие условия, при которых данный организм преодолевает конкуренцию остальных. Подбирая ряд факторов (источники энергии, углерода, азота, освещенность, температуру, рН и т.д.), создают определенные условия и инокулируют среду смешанной популяцией, какая имеется, например, в почве или в иле. Наиболее приспособленный к такой среде микроорганизм растет и вытесняет все остальные.

Условия, обеспечивающие преимущественное развитие определенной группы или вида микроорганизмов, называются элективными. Для культивирования микроорганизмов используют питательные среды различного составы и консистенции.

По составу среды бывают натуральные, полусинтетические и синтетические. По консистенции среды бывают жидкие (бульоны), полужидкие (содержат желатин, агар в малой концентрации) и твердые (агаризованные). По назначению среды бывают: – универсальные (предложены Р. Кохом) – на них растет большинство микроорганизмов. Примеры: МПА, МПБ, крахмало-аммиачный, картофельный агар и т.п. – элективные (предложены С.Н. Виноградским) – они составлены в расчете на предельно жесткие условия, при которых может развиваться только избранный организм. Примеры: среда Эшби, Виноградского. – накопительные (предложены М. Бейеринком). Для получения максимального эффекта накопления сочетают биофизические, биохимические и биологические методы.

21. Классификация микроорганизмов по типам питания и способам получения энергии.

В зависимости от того, в какой форме микроорганизмы получают из окружающей среды углерод, их подразделяют на две группы: автотрофные ("сами себя питающие"), использующие в качестве единственного источника углерода диоксид углерода, и гетеротрофные ("питающиеся за счет других"), получающие углерод в составе довольно сложных восстановленных органических соединений.

Таким образом, по способу получения энергии и углерода микроорганизмы можно подразделить на фотоавтотрофы, фотогетеротрофы, хемоавтотрофы и хемогетеротрофы. Внутри группы в зависимости от природы окисляемого субстрата, называемого донором электронов (Н-донором), в свою очередь, выделяют органотрофы, потребляющие энергию при разложении органических веществ, и литотрофы (от греч. lithos - камень), получающие энергию за счет окисления неорганических веществ. Поэтому в зависимости от используемого микроорганизмами источника энергии и донора электронов следует различать фотоорганотрофы, фотолитотрофы, хемоорганотрофы и хемолитотрофы. Таким образом, выделяют восемь возможных типов питания.

При фототрофии источник энергии - солнечный свет. К данной группе относят цианобактерий, пурпурных серных бактерий и зеленых серных бактерий.

Фотоорганогетеротрофия - тип питания, характерный для микроорганизмов, которые для получения энергии помимо фотосинтеза могут использовать еще и простые органические соединения. К этой группе относятся пурпурные несерные бактерии.

При хемотрофии энергетический источник - неорганические и органические соединения. Хемолитоавтотрофия - тип питания, характерный для микроорганизмов, получающих энергию при окислении неорганических соединений, таких, как Н2, NH4+, N02-, Fе2+, Н2S, S°, S0з2 - , S20з2-, СО и др. Сам процесс окисления называют хемосинтезом. Углерод для построения всех компонентов клеток хемолитоавтотрофы получают из диоксида углерода.

22. Рост микроорганизмов. Основные параметры и особенности отдельных фаз роста.

Термин «рост» означает увеличение массы клеток микроорганизмов в результате синтеза клеточного материала.

Интенсивность роста микроорганизмов можно определить делением их массы на численность особей в единице объема в отдельные промежутки времени. Рост индивидуальной клетки заканчивается размножением.

На кривой размножения различают четыре основные фазы роста культуры, сменяющие друг друга в определенной последовательности: начальная фаза (лаг-фаза), экспоненциальная, или логарифмическая (лог- фаза), стационарная фаза и фаза отмирания.

1-я - начальная, или лаг-фаза характеризуется началом интенсивного роста клеток, но скорость их деления остается невысокой;

2-я - логарифмическая, или лог-фаза она характеризуется постоянной максимальной скоростью деления клеток и значительным увеличением числа клеток в популяции;

3-я - стационарная фаза, она наступает тогда, когда число клеток в популяции перестает увеличиваться. Это связано с тем, что наступает равновесие между числом вновь образующихся и гибнущих клеток. Число живых бактериальных клеток в популяции на единицу объема питательной среды в стационарной фазе обозначается как М-концентрация. Этот показатель является характерным признаком для каждого вида бактерий;

4-я - фаза отмирания (логарифмической гибели), которая характеризуется преобладанием в популяции числа погибших клеток и прогрессивным снижением числа жизнеспособных клеток популяции.

Прекращение роста численности (размножения) популяции микроорганизмов наступает в связи с истощением питательной среды и/или накоплением в ней продуктов метаболизма микробных клеток. Поэтому, удаляя продукты метаболизма и/или заменяя питательную среду, регулируя переход микробной популяции из стационарной фазы в фазу отмирания, можно создать открытую биологическую систему, стремящуюся к устранению динамического равновесия на определенном уровне развития популяции. Такой процесс выращивания микроорганизмов называется проточным культивированием (непрерывная культура). Рост в непрерывной культуре позволяет получать большие массы бактерий при проточном культивировании в специальных устройствах (хемостатах и турбидистатах) и используется при производстве вакцин.

23. Рост бактерий в непрерывных и периодических культурах.

Периодическая культура – популяция клеток, растущая в ограниченном пространстве: питательные вещества не поступают, конечные продукты обмена не удаляются.

Кривая, описывающая зависимость логарифма числа живых клеток от времени, называется кривой роста. Типичная кривая роста имеет S-образную форму и различает несколько фаз роста, сменяющих друг друга.

1). Лаг-фаза начинается с момента посева бактерий в свежую питательную среду. В этот период клетки адаптируются к данным условиям культивирования и достигают максимальной скорости роста. Продолжительность лаг-периода зависит от многих факторов: биологических особенностей бактерий, возраста исходной культуры, состава питательной среды, температуры культивирования бактерий. Диауксия – двухфазный рост, наличие двух лаг-фаз. Это обычно происходит на средах, содержащих смесь питательных веществ.

2). Экспоненциальная, или логарифмическая (лог-фаза), характеризуется максимальной скоростью деления бактерий. Нарастание клеток идет в геометрической прогрессии. Общее количество бактерий определяется по формуле 1:

N = N0 × 2n, (1)

где N — общее количество клеток в конце опыта,

N0 — количество клеток в начале опыта,

n — число поколений или генераций.

В микробиологической практике для выражения общего числа клеток чаще пользуются не абсолютными числами, а их логарифмами. В экспоненциальной фазе процессы роста протекают сбалансированно. Эта фаза многостадийна, так как в начале ее бактерии растут в среде с избытком субстрата, затем концентрация его понижается, изменяется активность ферментов, возрастает содержание клеточных метаболитов.

3). Линейная фаза роста, характеризуется постоянной скоростью прироста биомассы. Наступление фазы объясняется качественными изменениями состава питательной среды: потреблением питательных веществ, накоплением продуктов метаболизма, дефицитом кислорода в среде, изменением рН среды и т. д.

4). Стационарная фаза роста, характеризуется равновесием между погибающими и вновь образующимися клетками. Скорость роста снижается не только из-за нехватки субстрата, но также из-за большой плотности бактериальной популяции, недостатка О2, или накопления токсичных продуктов обмена. В стационарной фазе наблюдается максимальная величина биомассы и максимальная суммарная численность клеток (урожай, или выход). В стационарной фазе клетки характеризуются несбалансированным ростом (клеточные компоненты синтезируются с различной скоростью), уменьшением интенсивности обменных процессов, более высокой устойчивостью к физическим и химическим воздействиям.

5). Фаза отмирания, характеризуется уменьшением числа живых клеток. В естественных условиях отмирание бактерий приводит к самоочищению природных сред. Число живых клеток может снижаться, когда в среде накапливаются кислоты, иногда клетки лизируются под действием собственных ферментов (автолиз).

6). Фаза выживания, характеризуется наличием отдельных клеток, сохранившихся в течение длительного времени, жизнеспособностью в условиях гибели большинства клеток популяции. При пересеве таких выживших клеток в свежую питательную среду, после лаг-периода они начинают активно расти и делиться. Выживающие клетки характеризуются низкой интенсивностью процессов метаболизма.

В непрерывной культуре рост культур происходит в емкости – ферментере при интенсивном перемешивании. Во всей массе культуры условия должны быть совершенно одинаковыми. Этот метод культивирования получил название гомогенно-непрерывного.

При больших потоках условия среды близки к экспоненциальному росту, при малых – приближаются к условиям стационарной фазы. При таком методе может быть воспроизведена любая точка роста периодической культуры. Повышение скорости потока приводит к тому, что скорость роста культуры окажется меньше коэффициента разбавления и культура вымоется из ферментера. Низкая скорость протока приведет к тому, что рост ускорится, а в ферментере повысится концентрация биомассы и понизится концентрация субстрата. Непрерывные процессы имеют преимущества перед периодическими:

– специализировать аппаратуру для каждой стадии процесса;

– автоматизировать процесс;

– стабилизировать процесс во времени;

– легко регулировать условия;

– установить особенности физиологического состояния клеток,

– изучить действие разных факторов в любой степени