Практическое применение метода Саузерн-блот:

- выявление точечных мутаций, затрагивающих сайты рестрикции (появляются новые или исчезают старые сайты рестрикции) по изменению количества и длины фрагментов рестрикции;

- выявление мутаций типа делении, дупликации, инсерции более длинных фрагментов (50-100 п.н.) по изменению длины фрагментов рестрикции.

Это позволяет проводить пренатальную и пресимптоматическую диагностику патологических мутаций и выявление гетерозиготных носителей мутантных генов.

Метод Саузерн-блот имеет, однако, следующие недостатки: (1) не позволяет выявить точечные мутации, не затрагивающие сайтов рестрикции (в пределах фрагмента рестрикции); (2) является достаточно трудоемким, сложным и дорогим методом.

Метод Нозерн-блот

Метод состоит в переносе разделенных молекул РНК на нейлоновые или нитроцеллюлезные фильтры с последующей гибридизацией с мечеными зондами. Метод схож с методом Саузерн-блот, за исключением того, что выделенные и очищенные мРНК не подвергают рестрикции, а электрофорез не происходит в условиях денатурации.

Метод Нозерн-блот позволяет идентифицировать транскрипты анализируемых генов, количества мРНК, их размеры.

Метод Бестерн-блот

Этот метод заключается в определении специфического белка из смеси клеточных белков. Для этого белки разделяют электрофорезом в условиях денатурации, в присутствии додецилсульфатa Na. Белки, разделённые по молекулярной массе, переносят на плотный фильтр и обрабатывают специфическими мечеными антителами. Этот метод позволяет определить наличие или отсутствие белка, его размер и скорость экспрессии гена по количеству синтезированного белка.

Техника пцр в анализе генов

Метод ПЦР используется для выборочного размножения определенной последовательности гена. В результате получают гомогенные популяции фрагментов, которые используются в исследованиях по молекулярной генетике или диагностике. Для осуществления амплификации определенной последовательности необходимо знать первичную структуру нормального или мутантного гена и синтезировать специфические праймеры, комплементарные концам интересующих фрагментов. Праймеры представляют собой искусственно синтезированные одноцепочечные олигонуклеотиды (20-30 нуклеотидов). ПЦР основана на гибридизации исследуемой последовательности ДНК - праймер и полуконсервативной репликации ДНК.

Преимущества метода ПЦР следующие: требуются минимальные количества ДНК; высокая скорость амплификации (за несколько часов получают более миллиона копий одинаковых фрагментов); благодаря специфичности праймера амплифицируетея только нужный фрагмент, который затем используется как зонд в других методах.

Использование техники пцр для обнаружения точечных мутаций при помощи специфичных для нормального гена праймеров

Практическое применение метода ПЦР:

- выявление известных мутаций у больных или носителей;

- пренатальная и пресимптоматическая диагностика генетических болезней;

- определение генов предрасположенности к распространенным болезням взрослого населения (коронаропатии, гипертония, психические расстройства и др.);

- ранняя диагностика и помощь в прогнозе онкологических заболеваний;

- пренатальное определение пола;

- выявление патогенных возбудителей (вирусов, бактерий);

- опознание личности методом геномной дактилоскопии;

- установление отцовства, материнства;

- типирование тканевых антигенов HLA.