7. Ферментативный катализ

Во многих случаях скорость реакции резко изменяется в присутствии специальных веществ - катализаторов. Катализаторы участвуют в реакции, но в результате ее не расходуются. Катализаторы биологических процессов, протекающих в живых организмах, представляют собой белковые молекулы, которые называютферментами, или энзимами.

Простейшая схема ферментативного катализа включает обратимое образование промежуточного комплекса фермента (E) с реагирующим веществом (субстратом, S) и разрушение этого комплекса с образованием продуктов реакции (P):

Применение квазиравновесного приближения к этой схеме (при условии k₂<<k_-1) с учетом уравнения материального баланса [E] = [E]₀- [ES] (индекс "0" обозначает начальную концентрацию) позволяет выразить скорость образования продукта через начальную концентрацию фермента и текущую концентрацию субстрата:

,

где K_S=k_-1/k₁= [E]. [S] / [ES] - субстратная константа. При увеличении концентрации субстрата скорость реакции стремится к предельному значению:w_max=k_2. [E]₀. Скорость реакции связана с максимальной скоростью соотношением:

. (7.1)

Обычно в эксперименте измеряют зависимость начальной скорости ферментативной реакции от начальной концентрации субстрата: w₀=f([S]₀). Проведение таких измерений для ряда начальных концентраций позволяет определить параметры уравнения (7.1) -K_Sиw_max.

Чаще всего для анализа кинетических схем ферментативного катализа используют метод стационарных концентраций (k₂>>k₁). Применение этого метода к простейшей схеме катализа даетуравнение Михаэлиса-Ментен:

, (7.2)

где w_max=k₂^. [E]₀- максимальная скорость реакции (при бесконечно большой концентрации субстрата),

- константа Михаэлиса. Эта константа равна концентрации субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной скорости. Типичные значенияK_M- от 10^-6до 10^-1моль/л. Константу скоростиk₂иногда называютчислом оборотов фермента. Она может изменяться в пределах от 10 до 10⁸мин^-1.

Уравнение (7.2) можно записать в других координатах, более удобных для обработки экспериментальных данных:

(7.2а)

(координаты Лайнуивера-Берка) или

. (7.2б)

Для определения параметров K_Mиw_maxпо уравнениям (7.2а) и (7.2б) проводят серию измерений начальной скорости реакции от начальной концентрации субстрата и представляют экспериментальные данные в координатах 1/w₀ё 1/[S]₀илиw₀ёw₀/[S]₀.

Иногда течение ферментативной реакции осложняется присутствием ингибиторов- веществ, способных образовывать комплексы с ферментом или фермент-субстратным комплексом. Различаютконкурентное,неконкурентноеи смешанное ингибирование.

При конкурентном механизме ингибитор (I) конкурирует с субстратом за активные участки фермента. Простейшая кинетическая схема данного процесса имеет вид:

Применение квазистационарного приближения к комплексу ES и квазиравновесного приближения к комплексу EI с учетом уравнений материального баланса [E] + [ES] + [EI] = [E]₀и [I] " [I]₀дает для скорости реакции уравнение типа (7.2):

, (7.3)

где эффективная константа Михаэлиса связана с исходной концентрацией ингибитора:

; (7.3а)

Величину K_I= [E]. [I] / [EI], которая представляет собой константу диссоциации комплекса фермента с ингибитором, называют константой ингибирования. Таким образом, при конкурентном ингибировании увеличивается константа Михаэлиса, а максимальная скорость ферментативной реакции остается неизменной.

При неконкурентном механизме ингибитор обратимо связывает промежуточный комплекс фермента с субстратом. Простейшая кинетическая схема данного процесса имеет вид:

,

где предполагается, что константы диссоциации комплексов EI и ESI одинаковы: [E]. [I] / [EI] = [ES]. [I] / [ESI] = K_I. Применение квазистационарного приближения к комплексу ES и квазиравновесного приближения к комплексам EI и ESI с учетом уравнений материального баланса [E] + [ES] + [EI] + [ESI] = [E]₀и [I] " [I]₀дает для скорости реакции уравнение типа (7.2):

, (7.4)

где эффективная максимальная скорость связана с начальной концентрацией ингибитора выражением:

. (7.4а)

При неконкурентном ингибировании максимальная скорость реакции уменьшается, а константа Михаэлиса остается неизменной.

Смешанное ингибирование описывается более сложными кинетическими схемами. При смешанном ингибировании изменяются и константа Михаэлиса, и максимальная скорость ферментативной реакции.

ПРИМЕРЫ

Пример 7-1.Найдите константу Михаэлиса и максимальную скорость гидролиза аденозинтрифосфата, катализируемого миозином, по следующим кинетическим данным:

Решение.Уравнение Михаэлиса-Ментен в данных координатах имеет вид (7.2б), следовательно, точки пересечения с осями имеют координаты: (0;w_max) для оси ординат, (w_max/K_M;0) для оси абсцисс. Первая точка пересечения дает значениеw_max= 2.1^.10^-6моль/(л. с). Вторая точка позволяет найти константу Михаэлиса:w_max/K_M= 14.6^.10^-3с^-1,K_M= 2.1^.10^-6/ 14.6^.10^-3= 1.44^.10^-4моль/л.

Пример 7-2.Ферментативная реакция (K_M= 2.7^.10^-3моль/л) подавляется конкурентным ингибитором (K_I= 3.1^.10^-5моль/л). Концентрация субстрата равна 3.6^.10^-4моль/л. Сколько ингибитора понадобится для подавления реакции на 65%? Во сколько раз надо повысить концентрацию субстрата, чтобы уменьшить степень подавления до 25%?

Решение.1) Конкурентное ингибирование описывается формулами (7.3) и (7.3а). 65%-ное подавление реакции означает, что скорость ингибируемой реакции составляет 35% от скорости реакции в отсутствие ингибитора:

,

откуда следует, что

.

В этой формуле известны значения K_M,K_Iи [S]. Концентрация ингибитора равна:

6.5^.10^-5моль/л.

Уменьшение степени ингибирования до 25% означает, что скорость ингибируемой реакции составляет 75% от нормальной:

,

где в данном случае известны K_M,K_Iи [I]₀. Отсюда можно выразить искомую концентрацию субстрата:

1.4^.10^-2моль/л.

Таким образом, для уменьшения степени ингибирования до 25% концентрацию субстрата надо увеличить в 1.4^.10^-2/ 3.6^.10^-4= 40 раз.

ЗАДАЧИ

7-1.Гидролиз ацетилхолина катализируется ферментом ацетилхолинэстеразой, число оборотов которой составляет 25000 с^-1. Сколько времени потребуется ферменту для расщепления одной молекулы ацетилхолина?(ответ)

7-2.Для некоторой ферментативной реакции константа Михаэлиса равна 0.035 моль/л. Скорость реакции при концентрации субстрата 0.110 моль/л равна 1.15^.10^-3моль/(л. с). Найдите максимальную скорость этой реакции.(ответ)

7-3.Начальная скорость окисления сукцината натрия в фумарат натрия под действием фермента сукциноксидазы была измерена для ряда концентраций субстрата:

[S], моль/л	0.01	0.002	0.001	0.0005	0.00033
w.106, моль/(л. с)	1.17	0.99	0.79	0.62	0.50

Определите константу Михаэлиса данной реакции.(ответ)

7-4.Начальная скорость выделения O₂при действии фермента на субстрат была измерена для ряда концентраций субстрата:

[S], моль/л	0.050	0.017	0.010	0.005	0.002
w, мм3/мин	16.6	12.4	10.1	6.6	3.3

Определите константу Михаэлиса данной реакции.(ответ)

7-5.Найдите константу Михаэлиса и максимальную скорость каталитического разложения гидроперекиси тетралина по следующим кинетическим данным:

(ответ)

7-6.Найдите константу Михаэлиса и максимальную скорость каталитического окисления циклогексенатрет-бутилпероксидом по следующим кинетическим данным:

(ответ)

7-7.Найдите константу Михаэлиса и максимальную скорость гидролиза карбобензилоксиглицилфенилаланина под действием карбоксипептидазы по следующим кинетическим данным:

(ответ)

7-8.Рассчитайте концентрацию неконкурентного ингибитора I (K_I= 2.9^.10^-4моль/л), необходимую для 90%-ного подавления ферментативной реакции.(ответ)

7-9.В некоторых случаях кинетические исследования ферментативных реакций проводят в условиях избытка фермента. Выведите уравнение Михаэлиса-Ментен, описывающее зависимостьначальнойскорости ферментативной реакции отначальныхконцентраций фермента и субстрата в системе

при условии, что концентрация фермента намного больше концентрации субстрата.(ответ)

*7-10.Рассмотрите механизм ферментативного катализа с двумя промежуточными комплексами:

Используя метод квазистационарных концентраций и уравнение материального баланса, покажите, что скорость реакции описывается уравнением типа Михаэлиса-Ментен (7.2). Найдите выражения для эффективной максимальной скорости и эффективной константы Михаэлиса через константы скорости отдельных стадий.(ответ)

7-11.Запишите уравнения конкурентного и неконкурентного ингибирования в координатах Лайнуивера-Берка. Представьте эти уравнения в графическом виде для трех разных начальных концентраций ингибитора (включая [I]₀= 0). Объясните, как можно определить константу ингибирования.(ответ)

7-12.Запишите уравнения конкурентного и неконкурентного ингибирования в координатахw₀w₀/[S]₀. Представьте эти уравнения в графическом виде для трех разных начальных концентраций ингибитора (включая [I]₀= 0). Объясните, как можно определить константу ингибирования.(ответ)

*7-13.Рассмотрите схему неконкурентного ингибирования с разными константами диссоциации комлпексов:

Используя квазистационарное приближение для ES и квазиравновесное приближение для EI и ESI, найдите начальную скорость реакции. Как связаны максимальная скорость реакции и константа Михаэлиса с соответствующими величинами для неингибируемой реакции?(ответ)