8.1 · Nicht-proliferative diabetische Retinopathie

Injektion auf, wenn die Insulindosis nicht angepasst wird. Bei Patienten mit Diabetes mellitus, die nicht mit Insulin behandelt werden, kann Sandostatin LAR entweder eine Erhöhung oder eine Erniedrigung der Blutglukose verursachen, abhängig von dem Einfluss auf die Glukagonsekretion.

Gastrointestinale Nebenwirkungen sind am häufigsten. Diarrhoen und Tenesmen treten bei einem Drittel der Patienten am Beginn der Octreotid-Behandlung auf. Sie manifestieren sich nach der ersten Injektion und können zu Beginn der Behandlung während der beiden folgenden Injektionen noch zunehmen. In der Regel verbessern sich diese Probleme jedoch bei den meisten Patienten innerhalb von drei Monaten. Übelkeit und Erbrechen sind seltenere Nebenwirkungen. Die gleichzeitige Anwendung von Pankreasenzymen führt zu einer Verbesserung der Nebenwirkungen. Hypothyreoidismus und Gallensteine treten selten nach längerer Therapie mit Octreotid auf. Lokale Reaktionen an der Injektionsstelle wie Schmerzen, Rötung und Schwellung sind ebenfalls selten.

Abschließende Beurteilung

Die Daten zur Anwendung für Octreotid bei der diabetischen Retinopathie sind variabel. Die besten Ergebnisse wurden in fortgeschrittenen Stadien der diabetischen Retinopathie und bei hohen Dosen von Sandostatin beschrieben.

Eine Wirkung konnte insbesondere bei einzelnen Patienten mit persistierenden Neovaskularisationen und Glaskörperblutungen nach Laserbehandlung oder Vitrektomie gefunden werden. Auch bei Patienten mit Rubeosis iridis zeigte sich bei Octreotid-Behandlung eine Besserung. Die Tatsache, dass insbesondere Patienten mit späten, neovaskulären Komplikationen profitieren, spricht dafür, dass IGF-1 vor allem in fortgeschrittenen Stadien der diabetischen Retinopathie als Progressionsfaktor beteiligt ist. Octreotid ist nicht für die Behandlung der diabetischen Retinopathie zugelassen.

8.1.4 Proteinkinase-C-Inhibitoren

Proteinkinase C (PKC) ist ein intrazelluläres, regulatorisches Protein, das bei der Entwicklung von mikrovaskulären Komplikationen des Diabetes mellitus eine Rolle spielt. Die PKC-β soll mittelbar und unmittelbar mit verantwortlich sein für die Entstehung des Makulaödems und der proliferativen diabetischen Retinopathie ( Abb. 8.5). Es wird vermutet, dass Inhibitoren der PKC-β einen therapeutischen Effekt auf die diabetische Retinopathie haben könnten.

Wirkungsmechanismus der Proteinkinase C und der PKC-Inhibitoren

PKC wird durch hohe Glukosespiegel aktiviert. Der Wirkungsmechanismus von PKC-β-Inhibitoren beruht auf der Beeinflussung der zellulären Signaltransduktion mittels Inhibition von spezifischen Proteinkinasen. Das Gleichgewicht von Kinasen und Phosphatasen ist von entscheidender Bedeutung für zelluläre Prozesse wie Wachstum, Differenzierung und Motilität.

Intrazelluläre Kinasen sind Enzyme, die Phosphatgruppen zu zellulären Proteinen hinzufügen. Die Proteinkinasen lassen sich nach der Natur der AkzeptorAminosäuren ihrer jeweiligen Substrate in vier Klassen unterteilen:

▬Serin-/Threonin-spezifische Proteinkinasen,

▬Tyrosin-spezifische Proteinkinasen,

▬Histidin-spezifische Proteinkinasen und

▬Aspartat-/Glutamat-spezifische Proteinkinasen.

Man unterscheidet außerdem drei große Gruppen von Serin-/Threonin-spezifischen Kinasen, die in allen Geweben zu finden sind:

▬cAMP-abhängige Proteinkinase (Proteinkinase A),

▬Proteinkinase B und

▬Kalzium-Phospholipid aktivierte Kinase (Proteinkinase C).

Abb. 8.5 Die Hyperglykämie führt zu einer Produktion von »advanced glycation endproducts« (AGE) und erhöhten Diacylglycerol (DAG)-Spiegeln. Dies führt zu einer Aktivierung von Proteinkinase β (PKCβ) und Überexpression von »vascular endothelial growth factor« (VEGF). Die durch PKCβ-induzierten Effekte können mit PKCβ-Inhibitoren rückgängig gemacht werden. (Aus Lang 2004)

Die PKC ist eine Serin/Threonin-Kinase, die sich im ganzen Körper findet und an zahlreichen Signalprozessen beteiligt ist. Im Wesentlichen ist die PKC beteiligt an Veränderungen der Ionenkanäle, Permeabilität, Rezeptorfunktionen, Zytoskelettstruktur, Proliferation, Apoptose, Zellteilung und Transkription.

Proteinkinase-C-Familie

Die Proteinkinase-C-Familie wurde erstmals 1977 als eine proteolytisch aktivierte Kinase in Rattengehirnen isoliert. Die PKC sind eine Familie von strukturell und funktionell verwandten Proteinen, die durch alternatives Splicing von einzelnen mRNA Transkripten entstehen.

Diese Kinasen sind üblicherweise im Zytoplasma lokalisiert. Die PKC-Familie ist gekennzeichnet durch unterschiedliche Strukturen und die dazu jeweilig erforderliche Kofaktoren und Substrate. Durch die Über- 8 tragung von Phosphat auf Serinund Threoningruppen steuert die PKC die Aktivität nachgeordneter Enzyme.

Basierend auf dieser regulatorischen Funktion spielt die PKC eine zentrale Rolle bei der zellulären Signaltransduktion. Diacylglycerin, Phospholipide und Kalziumionen sind für die Aktivität der PKC erforderlich. Die PKC lassen sich in drei Gruppen einteilen basierend auf dem Grad ihrer Abhängigkeit von Kalzium und Phospholipid. Die klassischen oder konventionellen Isoformen werden durch Diazylglyzerol (DAG) oder Phorbolester in einem Kalzium-abhängigen Prozess aktiviert. Die neuen PKCs werden ebenfalls durch DAG aktiviert, wobei die Aktivierung dieser Isoformen von Kalzium unabhängig erfolgt. Die Gruppe der sogenannten atypischen PKCs und der neuen atypischen PKCs sind durch DAG nicht aktivierbar. Derzeit umfasst das Spektrum der PKCFamilie 13 Isoenzyme.

Die PKC-Isoenzyme bestehen aus einer regulatorischen und katalytischen Region: C1 bis C4, wobei an die C1-Domäne Diacylglyzerol, Phosphatidylserin und

Phorbolester, an die C2-Region Kalzium und an die C3Region ATP binden ( Abb. 8.6).

Am NH2-Terminus der meisten PKCs befindet sich eine regulatorische Domäne von etwa 20-70 kDa, die die autoinhibitorisch wirkende Pseudosubstratdomäne enthält. Weiter zum COOH-Terminus hin befinden sich die C1und C2-Domäne. Durch Interaktion der katalytischen Untereinheit mit dem Pseudosubstrat wird die PKC in einem inaktiven Zustand gehalten. Durch Entfernung der autoinhibitorischen Pseudosubstratdomäne aus dem aktiven Zentrum wird die Bindung von DAG und Phosphatidylserin an die C1bzw. C2-Domäne möglich und die Kinase aktiviert. Bei Aktivierung kommt es zur Phosphorylierung von PKC. Die in verschiedenen Geweben exprimierten PKCs unterscheiden sich deutlich hinsichtlich Anzahl und Expressionsniveau. PKCs sind an Signalkaskaden beteiligt, die Wachstum und Differenzierung von Zellen kontrollieren. Die PKC-vermittelten Signalwege, die für Zellwachstum und Zelltod verantwortlich sind, werden isoenzymund zelltypspezifisch reguliert.

In den Gefäßen und der Retina werden die PKC-βI und -βII und-δ mehr als andere Isoenzyme exprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass die PKC-Aktivität korreliert mit steigender Plasma-Glukose-Konzentration.

Effekt der PKC-Aktivierung

Die Hyperglykämie führt zu erhöhten Spiegeln von AGE und DAG. Diese sind Aktivatoren der PKC ( Abb. 8.5). Dies führt über eine Dysregulation von verschiedenen zellulären Prozessen, in die PKC-Isoenzyme involviert sind wie die Überexpression von VEGF. Folge ist eine erhöhte Gefäßpermeabilität und die Entwicklung von Neovaskularisationen. In retinalen Perizyten kann die Expression von VEGF durch PKC aktiviert werden.

In-vitro-Studien belegen, dass die Aktivierung von PKC durch Phorbol-12-Myristat-13-Acetat oder hohe Glukosespiegel die Permeabilität von retinalen Endothelzellen steigert.

Abb. 8.6 Schematische Darstellung der primären Struktur der PKC Isoenzyme. Die PKC-Isoenzyme besitzen eine regulatorische (PS, C1-C2) und eine katalytische Region (C3-C4)

8.1.5Proteinkinase C und diabetische Retinopathie

Die Hyperglykämie ist assoziiert mit einem gesteigerten Polyol-Stoffwechsel, der Bildung von AGE und von reaktiven Sauerstoffspezies.

Die Hyperglykämie stimuliert die Neusynthese von DAG. DAG verursacht eine vermehrte Expression der gewebsspezifischen PKC-Isoformen. Dies wiederum führt zu einer Translokation der Isoform vom Zytosol in die Membran. Die Überexpression von PKC bewirkt auch eine Stimulation der Expression von VEGF. Erhöhte VEGF-Spiegel führen wiederum zu einer gesteigerten Aktivierung von PKC.

In vielen Studien fanden sich Hinweise dafür, dass die PKC-Aktivierung durch die Hyperglykämie beim Diabetiker im Zusammenhang mit den erhöhten DAG-Spie- geln in vaskulären Geweben steht. Dies gilt auch für die Retina. Neuere Studien haben ergeben, dass die PKC-β an vaskulären Dysfunktionen beteiligt ist, die durch Hyperglykämie induziert werden. Die intrazelluläre Freisetzung von DAG scheint der primäre Schritt zur Aktivierung der PKC zu sein.

Die durch Hyperglykämie induzierte PKC-Aktivie- rung spielt eine zentrale Rolle bei der Entstehung und Progression der diabetischen Retinopathie. Glukose gelangt in die Zellen und wird dann über die Glykolyse weiter verstoffwechselt. Dies führt zu einer Neusynthese von DAG. Erhöhte DAG-Spiegel sind in der Retina von Diabetikern gefunden worden. So führt eine Hyperglykämie zu einer verstärkten DAG-PKC Signaltransduktion in der Retina. Weiterhin spielen unabhängig von der DAG-Synthese auch Fettsäuren eine entscheidende Rolle in der Modulation der PKC-Aktivierung, jedoch scheinen die PKC-Isoenzyme der jeweiligen Gewebe unterschiedlich stark aktiviert zu werden. Dabei ist PKC-β ein wichtiges Isoenzym in der Retina. Ein möglicher Grund für die bevorzugte Aktivierung von PKC-β bei Diabetikern ist die hohe Sensitivität gegenüber DAG. Die Aktivierung der DAG-PKC Stoffwechselwege führt zu langfristigen, strukturellen und funktionellen Veränderungen, die mit mikrovaskulären Komplikationen assoziiert sind.

Das Gefäßendothel spielt eine Schlüsselrolle in der Regulation der Hämostase, dem Blutgefäßtonus, der vaskulären Permeabilität und der Thrombozytenaktivierung. Endotheliale Dysfunktion und Zellaktivierung führen zur Entwicklung der Mikroangiopathie. Bei biochemischer oder mechanischer Stimulation setzen endotheliale Zellen umfangreiche Substanzen frei, darunter unter anderem Angiotensin II, Endothelin-1 (ET-1), TGFβ, VEGF und Prostaglandine. Dabei ist die PKC-Aktivierung ein biochemisch wichtiger Schritt in der durch Hyperglykä-

mie verursachten endothelialen Dysfunktion. Durch die PKC wird die NO-vermittelte Vasodilatation gehemmt. Dies ist von Bedeutung, da eine Hemmung der PKC die retinale, mikrovaskuläre Hämodynamik wieder normalisieren kann.

Die Adhäsion von Monozyten an endotheliale Zellen der Gefäßwand ist bei Diabetes mellitus verstärkt. Die Membran-assoziierte PKC-Aktivität von Monozyten, die bei Diabetikern deutlich erhöht ist, spielt dabei eine Rolle.

Die Aktivität der PKC ist auch für die Regulation der Hormonrezeptorendichte an der Zelloberfläche von Bedeutung. Sie ist involviert in intrazelluläre Signalantworten, Ionenkanal-Aktivitäten, dem intrazellulärem pH und der Phosphorylierung von Proteinen. Auch die bei Diabetikern beobachtete erhöhte reaktive Kontraktilität der glatten Gefäßmuskulatur wird verursacht durch eine PKC-Aktivierung, an der die Hyperglykämie kausal beteiligt ist. Veränderungen der intrazellulären Kalziumkonzentration sind mit der PKC-Aktivierung verknüpft und modulieren über Wachstumsfaktoren induzierte Mitogenese und Kontraktion. Auch die Apoptose der glatten Gefäßmuskelzellen ist PKC abhängig.

Wirkung der PKC-Aktivierung

Der Verlust der endothelialen Barrierefunktion ist ein frühes pathophysiologisches Phänomen der diabetischen Retinopathie. Dabei spielt die durch PKC vermittelte Phosphorylierung und Relaxation von zytoskeletalenund Adhäsionsproteinen wie Caldesmon, Vimentin, Talin und Vinulin eine Rolle. Diese Proteine sind mitverantwortlich für die pathologische Gefäßpermeabilität, die bei erhöhten Glukosespiegeln gefunden werden. Dabei scheint VEGF der primäre Mediator der gestörten Gefäßpermeabilität zu sein, ebenso wie auch der Neoangiogenese. In Augen von Diabetikern mit Retinopathie sind erhöhte VEGF-Spiegel gefunden worden. Bei erhöhten Glukosespiegeln ist die VEGF-Genexpression auch von der PKC abhängig.

Die Verdickung der kapillären Basalmembran und die Vermehrung der extrazellulären Matrix sind die im Vordergrund stehenden vaskulären Veränderungen in der Frühphase der Entwicklung der diabetischen Retinopathie. Die Basalmembran spielt eine Rolle bei der vaskulären Permeabilität, der zellulären Adhäsion, Zellproliferation, Zelldifferenzierung und Genexpression. Kollagen vom Typ IV und VI sowie auch Fibronektin werden beim Diabetiker vermehrt produziert. PKC-Inhibitoren können diese Effekte verhindern.

Bei der Verdickung der Basalmembran und der Synthese von extrazellulärer Matrix spielen insbesondere auch TGF-β und der »connective tissue growth factor« (CTGF) eine Rolle. Die Expression von TGF-β und CTGF können durch einen PKC-Inhibitor blockiert werden.

Experimentelle Studien zu Inhibitoren der Proteinkinase C

In tierexperimentellen Studien konnte gezeigt werden, dass die intravitreale Injektion von VEGF zu einer raschen Aktivierung der PKC in der Retina, einer Membrantranslokation der PKC-Isoformen α, βII und δ und einer dreifach erhöhten retinalen Gefäßpermeabilität führte. Welche Rolle dabei die PKC exakt spielt, ist jedoch noch unklar. Eine intravitreale oder orale Applikation von PKC-Inhibitoren reduzierte in dieser Studie die gesteigerte Gefäßpermeabilität.

Saishin et al. (2003) konnten an einem Schweinemodell für chorioidale Neovaskularisation zeigen, dass durch periokulare Injektionen von mit dem Inhibitor PKC412 beladenen Mikrosphären signifikant kleinere CNV gefunden wurden im Vergleich zur Kontrollgruppe.

Seo et al. (1999) konnten in einem Mausmodell mit ischämischer Retinopathie und mit durch Laser induzier- 8 ten chorioidalen Neovaskularsationen nachweisen, dass durch einen selektiven PKC-Inhibitor CGP 41251 retinale Neovakularisationen bei Mäusen mit ischämischer Retinopathie und chorioidale Neovaskularisation nach Laser-induzierter Ruptur der Bruchschen Membran ver-

hindert werden konnten.

Danis et al. (1998) zeigten an einem Schweinemodell, dass mit dem spezifischen PKC-Inhibitor LY333531 die Entwicklung von präretinalen Neovaskularisationen nach Venenastverschluss effektiv verhindert werden konnte. Dies legt nahe, dass die PKC an der Entwicklung von Neovaskularisationen, die durch Ischämie bedingt sind, beteiligt ist.

In einem Mausmodell für Diabetes mellitus Typ 2 konnte nachgewiesen werden, dass der PKC-Inhibitor Ly333531 (Lilly) eine durch Diabetes mellitus induzierte retinale erhöhte Gefäßdurchlässigkeit und retinale Neovaskularisationen verhindern konnte.

In diabetischen Ratten konnte mit einer Behandlung mit Ruboxistaurin Mesylat eine dosisabhängige Verbesserung des retinalen Blutflusses und eine Reduzierung der retinalen PKC-Aktivität erzielt werden.

Nach neueren Untersuchungen von Deissler et al. (2010) scheinen die PKC-Inhibitoren bei Diabetes mellitus aber nicht vorwiegend über eine Hemmung der VEGF-Effekte zu wirken. Immortalisierte, bovine, retinale Endothelzellen wurden mit PKC inkubiert. Dies führte zu einer Delokalisation von Claudin-1, einem wichtigen Schrankenprotein der Tight-junctions ( Abb. 8.7). Dies konnte mit einem PKC- δ-Inhibitor rückgängig gemacht werden. Wurden die Zellen allerdings mit VEGF165 über längere Zeit inkubiert, so konnten die Delokalisation von Claudin-1 und die dadurch verursachte Schrankenstörung – gemessen am transendothelialen Widerstand

– mit keinem PKC-Inhibitor, insbesondere auch nicht

mit einem PKC-β-Inhibitor, rückgängig gemacht werden. In diesem präklinischen Modell zeigte sich, dass die verschiedenen PKC-Isoformen nicht wesentlich an der durch VEGF165 initiierten Signaltransduktion beteiligt sind, die zu einer Delokalisation von Claudin-1 führt und eine gesteigerte Zellpermeabilität verursacht.

Studien mit Proteinkinase-Inhibitoren

Die Behandlung von Patienten mit diabetischem Makulaödem (DMÖ) mit PKC412, einem Inhibitor verschiedener Isoformen der PKC und VEGF-Rezeptoren, für 3 Monate führte zu einer Reduktion der Netzhautdicke in der optischen Kohärenztomographie (OCT). Die Studien mit dem unspezifischen PKC-Hemmer PKC412 zeigten schwere Nebenwirkungen wie gastrointestinale Beschwerden und Lebertoxizität, sodass die Studien eingestellt wurden.

zRuboxistaurin

Das einzige Präparat, das sich bis vor Kurzem noch in einer klinischen Studie befand, ist Ruboxystaurin. Ruboxistaurin Mesylat (LY333531, Eli Lilly) wurde 1994 entwickelt. Es handelt sich um ein Bisindolylmaleimid. Es ist ein Isoenzym-selektiver PKC-Inhibitor, der oral verabreicht wird. Ruboxistaurin Mesylat ist der am selektivsten wirkende PKC-Inhibitor.

Ruboxistaurin Mesylat (Ly333531) ist ein spezifischer Inhibitor der beiden Isoformen PKC-βI und -βII. Durch Inhibition von PKC-β wird versucht, die diabetische Retinopathie zu behandeln. Ruboxistaurin wird einmal täglich oral verabreicht. Die Halbwertszeit des Metaboliten, N-Desmethyl-Ruboxistaurin beträgt etwa 16 h.

Die PKC-Diabetic Retinopathy Study (PKC-DRS) war eine Phase III, multizentrische, randomisierte, maskierte, placebokontrollierte Studie an 252 Patienten, die entweder Placebo, 8 mg, 16 mg oder 32 mg Ruboxistaurin pro Tag über 3 Jahre erhielten. Der primäre Endpunkt war eine Progredienz der diabetischen Retinopathie um 3 ET- DRS-Stufen oder eine panretinale Laserbehandlung.

Einschlusskriterien waren ein ETDRS-Level von 47b-53e und ein bestkorrigierter Visus von mindestens 45 Buchstaben. Der Ausgangsvisus lag im Mittel bei 80 Buchstaben. Der primäre Endpunkt wurde nicht erreicht. Bezüglich des sekundären Endpunktes zeigte sich bei der 32-mg-Gruppe eine signifikante Reduktion des Visusverlustes um 3 Zeilen.

In der PKC-Diabetic Macular Edema Study (PKCDMES, MBBK Trial) wurden 686 Patienten in einer multizentrischen, prospektiven, randomisierten, placebokontrollieren Phase-III-Studie untersucht. Die Patienten wurden randomisiert zu 4 mg, 16 mg oder 32 mg Ruboxistaurin pro Tag. Die Dauer der Studie betrug 3 Jahre. Der primäre Endpunkt war die Progredienz des Makulaödems innerhalb von 100 μm zum Zentrum der Makula

oder eine erforderliche fokale oder Gridlaser-Behandlung. Die Patienten hatten eine Makulaverdickung zwischen 300 und 3.000 μm vom Zentrum der Makula und eine nicht proliferative diabetische Retinopathie. Der bestkorrigierte Visus betrug mindestens 75 Buchstaben. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen. Beim direkten Vergleich der 32-mg-Gruppe mit Placebo zeigte sich ein signifikanter Unterschied.

In der PKC-Diabetic Retinopathy Study 2 (PKCDRS2, MBCM Trial) wurde als primärer Endpunkt die Progredienz der diabetischern Retinopathie oder die panretinale Laserkoagulation gewählt und dann aufgrund der Ergebnisse der anderen beiden Studien in mäßigen Visusverlust geändert. Es handelte sich ebenfalls um eine prospektive, randomisierte, placebokontrollierte Phase- III-Studie mit 685 Patienten, die Placebo oder 32 mg Ruboxistaurin über 3 Jahre erhielten. Der primäre Endpunkt war der anhaltende signifikante Visusverlust von mindestens 3 Zeilen. Der bestkorrigierte Visus bei Einschluss betrug mindestens 45 Buchstaben. Der mittlere Visus bei Einschluss betrug 77 Buchstaben. Es zeigte sich ein um 40% reduziertes Risiko des Visusverlustes in der Verumgruppe im Vergleich zu Placebo (p=0,034).

In einer Phase-III-Studie konnte bereits gezeigt werden, dass Ruboxistaurin bei bestimmten Patientengruppen die Progredienz des diabetischen Makulaödems signifikant reduziert.

In den multizentrischen Studien wird derzeit untersucht, ob Ruboxistaurin Mesylat die Progredienz des diabetischen Makulaödems und der diabetischen Retinopathie aufhalten kann.

Nebenwirkungen

Es wurden über 2.000 Patienten mit Ruboxistaurin behandelt und es erwies sich als gut verträglich. Selten kommt es zu Dypepsie, Diarrhöen, Kopfschmerzen, Nasopharyngitis oder Husten.

Zusammenfassende Beurteilung

Die Überexpression von Proteinkinase spielt pathogenetisch im Rahmen der diabetischen Retinopathie eine Rolle. Es zeigte sich eine Wirkung der spezifischen PKCInhibition in tierexperimentellen und klinischen Studien. Ob die PKC-Inhibitoren zu Therapie geeignet sind und ggf. zugelassen werden, wird sich herausstellen, wenn die endgültigen Studienergebnisse vorliegen.