Anti-VEGF-Therapie: Grundlagen und Substanzen

Kernaussagen

▬Der »vascular endothelial growth factor« (VEGF)-A wird durch mehrere sog. Isoformen repräsentiert, die sich u. a. durch ihre Molekülgröße, Bindungsaffinität und Funktion unterscheiden.

Augenheilkunde als besonders erfolgreich nicht nur im Konzept, sondern auch in der Klinik erwiesen. Die bisher erfolgreichste Behandlungsform der neovaskulären AMD stellt aber nur den ersten Schritt dieser neuen therapeutischen Strategie dar. Neben den derzeitig klinisch eingesetzten Medikamenten werden neue Subs-

ein.

▬VEGF-A ist ein potenter Stimulator der pathologischen Gefäßneubildung, wie sie auch im Rahmen neovaskulärer Erkrankungen am Auge vorzufinden sind.

▬Die direkte Blockade von VEGF-A bzw. einzelner Isoformen mittels Antikörper, Antikörperfragmente und Aptamere hat sich als eine mehr oder weniger wirksame Therapie neovaskulärer Prozesse am Auge etabliert.

▬In aktuellen Studien werden derzeit neue Substanzen und Strategien getestet, die die VEGF-Kaskade und somit die VEGF-Wirkung anderen Schaltstellen inhibieren sollen.

14.1Einleitung

Die Angiogenese ist ein physiologischer und lebensnotwendiger Prozess. Unter bestimmten Umständen kann dieser aber auch Ausdruck krankhafter Mechanismen sein. Man spricht dann von pathologischen Neovaskularisationen. Diese können im Rahmen neoplastischer Prozesse auftreten. In den meisten Fällen handelt es sich aber um ein reaktives Ereignis auf ein sich veränderndes

14 Milieu. Hierzu zählen insbesondere hypoxische und entzündliche Vorgänge. Neovaskularisationen am Auge wirken sich durch die besondere Anatomie und Funktion des Organs meistens funktionsbeeinträchtigend aus und können letztendlich zur Erblindung oder Verlust des Auges führen. Zahlreiche Studien weisen den Faktor VEGF (»vascular endothelial growth factor«) als potenten Stimulator okulärer Neovaskularisationen aus. Die Inhibition dieses Faktors hat sich deshalb in der

zu hemmen.

14.2Vascular endothelial growth factor

VEGF-A, im folgenden auch als VEGF bezeichnet, ist der am besten untersuchte Repräsentant der VEGF-»platelet- derived-growth-factor« (PDGF)-Supergen-Familie. Zu dieser Familie gehören außerdem VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E (ein viral kodiertes Protein) und der placental growth factor (PIGF) ( Abb. 14.1). Durch alternatives Spleißen des kodierenden Strangs tritt VEGF-A in unterschiedlichen Isoformen auf. Die vier dominierenden Varianten sind VEGF-121, -165, -189 und -206 ( Abb. 14.2). Die charakterisierende Zahl weist dabei auf die Anzahl der enthaltenen Aminosäuren hin. Die unterschiedlichen Isoformen enthalten zwar gemeinsame Signalsequenzen, abhängig von ihren Bindungsdomänen sind sie jedoch mehr oder weniger löslich. VEGF-121 ist ein frei diffundierendes Protein. VEGF-165 nimmt über seine Heparinbindung eine Zwischenstellung ein. VEGF189 und VEGF-206 weisen neben der Heparinauch eine Heparanbindungsdomäne auf. Zusätzliche Elemente mit basischen Endgruppen bewirken eine überwiegende Sequestration in der extrazellulären Matrix. Außerdem kann eine proteolytische Modifikation der Spleißvarianten ihre Bindung an die Rezeptorstrukturen beeinflussen [9].

Die Mitglieder der VEGF-Familie unterscheiden sich in ihrer Bindungsaffinität zu den 3 bisher entdeckten Rezeptor-Tyrosinkinasen (RTK) ( Abb. 14.3). VEGF bindet hauptsächlich an VEGFR-1 (Flt-1) und VEGFR-2 (KDR, Flk-1). VEGR-2 scheint der wesentliche Mediator der mitogenen, angiogenen und Per- meabilitäts-induzierenden Eigenschaften von VEGF zu sein. VEGFR-1 wird hingegen in begrenzten Umfang

Abb. 14.1 »Vascular endothelial growth factor« (VEGF)-A gehört zur VEGF-»platelet- derived-growth-factor« (PDGF)-Supergen- Familie und wird in unterschiedliche Isoformen unterteilt

VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, PlGF

VEGF-A110 , VEGF-A121 , VEGF-A143 , VEGF-A165 , VEGF-183 , VEGF-A189 , VEGF-A206

14.3 · Angriffspunkte innerhalb der VEGF-Kaskade

eine Rolle als »Abfang«-Rezeptor zugeschrieben, der eine übermäßige Aktivierung biologischer Prozesse verhindert. Weiterhin scheint VEGFR-1 wesentlich an der Rekrutierung von entzündlichen Zellen beteiligt zu sein. Zusätzlich gibt es sog. Korezeptoren (Neuropiline und Heparansulfatproteoglykane), die wahrscheinlich die Verteilung und Aktivierung der VEGF-Rezeptoren sowie die Signaltransduktion und Stabilität des zellulären Signalkomplexes beeinflussen [19].

Die Vielfalt der VEGF-Familie und VEGF-A-Isofor- men sowie der Rezeptorstrukturen und intrazellulären Signalketten ist ein Hinweis auf das komplexe Wirken der Beteiligten und die daraus resultierende funktionelle Vielfalt. Auf diese Weise ist eine feine Steuerung physiologischer und pathologischer Abläufe möglich. Zu diesen Prozessen gehören Hämatopoese, Hämodynamik, Hormonfreisetzung, Immunabwehr und Wundheilung.

Weiterhin werden diesen Faktoren neuroprotektive Eigenschaften zugeschrieben. Die eigentliche Schlüsselrolle von VEGF wird jedoch in der Angiogenese und Gefäßpermeabilität gesehen. Die Inhibition dieser zwei Eigenschaften stellt einen wesentlichen Schritt in der Behandlung neovaskulärer Augenerkrankungen und insbesondere der exsudativen AMD dar.

14.3Angriffspunkte innerhalb der VEGF-Kaskade

Die zunächst eingeführten und im folgendem benannten Substanzen inhibieren den freigesetzten Faktor VEGF. Strategische Inhibitionspunkte finden sich jedoch auch in der Synthese, Rezeptorbindung und intrazellulären Kaskade ( Abb. 14.4).

Abb. 14.2 VEGF-A121, -A165, -A189 und -A206 sind die 4 dominanten Isoformen. Diese differieren durch unterschiedliche Bindungsdomänen, die ihre Löslichkeit beeinflussen

14.3.1 Sequestrierung von freiem VEGF

Pegaptanib-Natrium ist der erste VEGF-A-Inhibitor zur Behandlung der feuchten AMD. Die Substanz wurde unter dem Handelsnamen Macugen (OSIEyetech Pharmaceuticals/Pfizer) im Dezember 2004 in den USA durch die FDA und 2006 in Europa durch die EMEA zugelassen.

Pegaptanib-Natrium ist ein Aptamer, ein chemisch synthetisiertes Oligonukleotid (kurzer RNS-Strang), das selektiv und mit hoher Affinität die VEGF-A Isoformen

(VEGF-A165,-A189, A-201) bindet, die über eine Heparinbindungsdomäne verfügen ( Abb. 14.2). Der Begriff Aptamer setzt sich aus den griechischen Wörter απτειν (bin-

den) und μερος (Teil, Region) zusammen und bezeichnet die Eigenschaft der Nukleotide, zu einer bestimmten Region des Zielproteins zu passen und an diese zu binden. Eine besonders hohe Bindungsspezifität wird dadurch erreicht, dass sich die 3D-Struktur des Oligonukleotides in ihrer Konformation genau um den Bindungspartner herumfaltet. Das aus 28 Ribonukleinsäuren zusammen-

14 gesetzte Molekül ist pegyliert, d. h., an jedem Ende sind zwei 20 kDa Polyethylenglykol-Moleküle gebunden, die unter anderem das Molekül vor einem raschen Abbau schützen [17].

Die Bindungsaffinität und Wirksamkeit von Pegaptanib wurde in In-vitro-Studien nachgewiesen [2]. In weiteren Arbeiten zeigte sich, dass Pegaptanib im menschlichen Plasma über 18 h stabil bleibt. Zudem erfolgten weitere Testungen im Tiermodell. In Rhesusaffen zeigte sich nach einmaliger intravenöser oder subkutaner Injektion von Pegaptanib (jeweils 1 mg/kg KG) eine Halbwertszeit von 9,3 bzw. 12 h [21].

Nach einmaliger intravitrealer Injektion von 0,5 mg persistierten die biologisch aktiven Pegaptanib-Moleküle für mindestens 28 Tage im Glaskörper [5]. Die Clearance erfolgte über eine renale Elimination aus dem Plasma; entsprechend muss mit einem erhöhten Spiegel bei Niereninsuffizienz gerechnet werden. Im Affenmodell wurde

weder nach systemischer noch nach intravitrealer Gabe ein Anhalt für Toxizität festgestellt.

Eine fundamentale Basis für die Entwicklung von Macugen waren Ergebnisse von Studien, die nachweisen konnten, dass VEGF165 eine zentrale Rolle im Rahmen von Neovaskularisationsprozessen einnimmt [10], jedoch im Vergleich zur kompletten VEGF-Blockade physiologische Gefäße unbeeinflusst bleiben [22]. Die selektive Hemmung einzelner VEGF-A-Isoformen sollte bei gleicher Effektivität weniger Nebenwirkungen verursachen. Die Verteilung und die Rolle der einzelnen Isoformen im menschlichen Auge und bei der AMD scheinen sich jedoch vom Tiermodel zu unterscheiden.

Ranibizumab (Lucentis, Genentech/Novartis) wurde als zweiter VEGF-Inhibitor zur Behandlung der exsudativen Form der AMD im Juni 2006 in den USA durch die FDA und 2007 in Europa durch die EMEA zugelassen. Ranibizumab ist ein humanisiertes antigenbindendes Antikörperfragment (Fab), das alle Isoformen von VEGF-A bindet. Das Antikörperfragment wurde entwickelt, um besser durch die Netzhaut zu penetrieren [7]. Das Antikörperfragment entstammt einem monoklonalen Vollantikörper der Maus, der gegen humanes VEGF-A gerichtet ist. Die Bindungsdomänen innerhalb der leichten Ketten (Fab-Fragment) wurden mehrfach modifiziert, um eine im Vergleich zum Ausgangsmolekül ca. 50-fach erhöhte Bindungsaffinität zu erreichen. Das Fab-Fragment soll zusätzlich durch das Fehlen des sog. Fc-Anteils und dessen pro-entzündlichen Eigenschaften im Vorteil sein. Die Halbwertszeit von Ranibizumab ist gegenüber dem Vollantikörper deutlich verkürzt. Dies kann nachteilig für die Depotwirkung im Auge sein, ist aber von Vorteil im Bezug auf den Systemkreislauf. Die systemische Halbwertzeit des Fragments beträgt nur wenige Stunden, wohingegen die des Vollantikörpers mehrere Wochen beträgt.

Bevacizumab (Avastin, Genentech/Roche) ist solch ein Vollantikörper, der gegen VEGF-A gerichtet ist. Das Medikament wurde für die systemische intravenöse Gabe

konzipiert und im Februar 2004 von der FDA in den USA für die Behandlung des metastasierten Kolonkarzinoms zugelassen. Unter dem Eindruck der ersten Studienergebnissen mit Ranibizumab (Lucentis) und im Hinblick auf die noch nicht erfolgte Zulassung desselben wurde der Vollantikörper zunächst systemisch dann intravitreal bei Patienten mit AMD angewandt. Mit zunehmender Zahl der Anwendungen erfolgten in umgekehrter Reihenfolge eine Vielzahl von In-vitro- und In-vivo-Untersuchungen, um die Effektivität, Toxizität und Biokompatibilität der Substanz zu ermitteln. Es konnte nachgewiesen werden, dass der Vollantikörper ebenfalls in der Lage war, die Netzhaut zu penetrieren und somit subretinale Pathologien zu erreichen [1]. In Rahmen von experimentellen und klinischen Studien wird derzeit ermittelt, ob die signifikanten molekularen Unterschiede zwischen Ranibizumab und Bevacizumab zu messbaren biologischen und klinischen Unterschieden führt.

Die Autoren der bisher einzigen randomisierten Vergleichsstudie (CATT-Studie) folgerten auf der Basis der 1-Jahres-Ergebnisse, dass Bevacizumab und Ranibizumab äquivalente Visusergebnisse erzielten, wenn sie im Rahmen des gleichen Therapieregimes verabreicht wurden [20].

VEGF-Trap (Aflibercept, Regeneron/Bayer) funktioniert ähnlich wie ein Antikörper. Es handelt sich jedoch dabei um ein fusioniertes Protein, bestehend aus den Schlüsseldomänen der humanen VEGF1und VEGF2-Rezeptoren, die mit einen Fc-Teil eines humanen IgG-Moleküls gekoppelt sind. Das gesamte Molekül besteht ausschließlich aus humanen Aminosäuren, wodurch Reizzustände möglicherweise verringert werden können. VEGF-Trap hat eine deutlich höhere Affinität zum VEGF-Molekül als der normale VEGF-Rezeptor von Endothelzellen und ebenfalls eine höhere Affinität als VEGF-Antikörper wie z. B. Bevacizumab. VEGF-Trap bindet nicht nur VEGF-A, wie es bei Bevacizumab oder Ranibizumab der Fall ist, sondern auch alle anderen VEGF-Formen (A–D) sowie PlGF. Nachdem die intravenöse Anwendung zu Hypertonien und anderen schwerwiegenden kardiovaskulären Nebenwirkungen führte [14], steht nun die intravitreale Anwendung im Vordergrund des klinischen Einsatzes. Das Molekulargewicht von 110.000 D ermöglicht eine vollständige Penetration der Retina. Durch die hohe Affinität zu VEGF erhofft man sich eine gute Aktivität bei niedrigerer Dosierung und besonders langer Halbwertzeit [6].

Anticaline (Pieris) sind eine weitere Alternative zur Antikörperstrategie. Es handelt sich dabei um eine neue Wirkstoffgruppe, die den Lipocalinen entstammt. Lipocaline gehören zu einer Familie natürlicher humaner Proteine, die Transportund Speicherfunktionen haben. Durch molekulargenetische Veränderungen an der Bindungsstelle können unterschiedliche Proteine nach dem

Schlüssel-Schloss-Prinzip abgefangen werden [8]. PRS055 ist ein Anticalin, das speziell zur Blockade von freiem VEGF konzipiert wurde.

Rezeptor-Chimären wie sFLT01 (Genzyme Corp.) setzen sich ähnlich dem VEGF-Trap aus einer Immunoglobulin (IgG)-ähnlichen Domäne und dem VEGFR1 (Flt-1) zusammen. Dieses Mischprotein wird jedoch nicht am Ort des Geschehens injiziert sondern durch rekombinante adeno-assoziierte Viren (rAAV) induziert. In-vitro-Analysen konnten eine hohe Bindungsaffinität für VEGF nachweisen. Im Mausmodel konnte durch die intravitreale Injektion der Virusvektoren die Expression von sFLT1 induziert und die sonst auftretende Angiogenese inhibiert werden [15]. Ein Vorteil des Ansatzes ist die längerfristige Präsenz des Inhibitors aufgrund der virusinduzierten intraokularen Synthese. Demgegenüber steht aber das noch nicht ausreichend abzuschätzende Risiko von Neoplasien durch adenovirale Vektoren.

14.3.2Inhibition der Synthese von VEGF und VEGF-Rezeptoren

Small interfering RNA (siRNA) setzt anders als die bisher genannten Substanzen nicht an dem sezernierten Molekül an, sondern greift die intrazelluläre Synthese an. Auf RNAInterferenz basierte Therapien nutzen synthetisch hergestellte kleine RNA-Fragmente, die durch Bindung und Abbau entsprechender mRNA (messenger-RNA) die Wirkung eines Gens stilllegen. Die gesunde Zelle nutzt diesen Mechanismus z. B. im Kampf gegen RNA-Viren. Es werden durch ein einziges siRNA-Molekül zahlreiche mRNAStränge abgebaut, aus denen sonst wiederum pro-mRNA- Strang viele Protein-Kopien hervorgegangen wären [17]. Es handelt sich deshalb um einen sehr potenten Wirkmechanismus: Es wird nicht erst wie bei den Antikörpern oder Aptameren das extrazellulär zirkulierende VEGF-Protein geblockt, sondern schon zu einem früheren Zeitpunkt der Kaskade die intrazelluläre Synthese des VEGF-Proteins verhindert. Ein weiterer möglicher Ansatzpunkt für siRNA ist der gezielte Abbau der VEGF-Rezeptor mRNA.

Bevasiranib (Acuity Pharmaceuticals) legt das VEGFsynthetisierende Gen still, während Sirna-027 (Sirna/Allergan) das Gen, das für den VEGF-Rezeptor 1 kodiert, ausschaltet. Nach intravitrealer Injektion gelangt kaum aktiver Wirkstoff in die systemische Zirkulation, wodurch das Risiko thrombembolischer Komplikationen reduziert wird. Die Wirkung setzt erst nach einer Latenzzeit ein, nämlich wenn das noch vorhandene VEGF eliminiert ist. Dafür ist die Wirkdauer der siRNA besonders lang anhaltend (mindestens 12 Wochen), so dass die Anzahl der erforderlichen intravitrealen Injektionen und damit

das kumulative Operationsrisiko (z. B. Endophthalmitis) im Vergleich zu den bisherigen Therapien mit kürzeren Injektionsintervallen reduziert werden kann.

14.3.3Inhibition der intrazellulären Signalkaskade

Die Aktivierung der VEGF-Rezeptoren führt zu einer Aktivierung eines komplexen Spektrums an intrazellulären Signalkaskaden. Die Signalkaskade induziert unter anderem die Phosphorylierung von unterschiedlichen Proteinen wie z. B. PI3, MAPK und PKC.

Anti-human-VEGF-Rezeptor Flt-1-Antikörper oder -Peptide (Kyowa Hakko Kogyo KK) konkurrieren mit VEGF um die Rezeptorbindungsstelle. Die Bindung derselben am Rezeptor induziert im Gegensatz zum Wachstumsfaktor selbst keine Rezeptoraktivierung [12]. Der humanisierte Antikörper wird in Hybridomazellen produziert.

Rezeptor-Tyrosinkinase-Inhibitoren blockieren die intrazelluläre Kaskade, die nach der Rezeptorbindung einsetzt. Während Vatalanib (Novartis) nur die VEGFRezeptoren (VEGFR1 bis 3) inhibiert, blockiert ein anderer Tyrosinkinase-Hemmer (AG-013958, Allergan) auch den Rezeptor für PDGF (»platelet derived growth factor«). Vatalanib wird oral (z. B. 1250 mg/Tag) eingesetzt und bietet damit eine gering invasive Applikation, hat aber den Nachteil eines höheres Risikos an systemischen Komplikationen. AG-013958 hingegen wird unter die Tenon-Kapsel injiziert. Bei beiden wurde eine gute Verträglichkeit festgestellt. Weitere Studien müssen die Wirksamkeit, exakte Dosierung und Applikationsfrequenz noch testen. Im Tiermodell zeigte sich ein Rückgang experimentell erzeugter choroidaler Neovaskularisatio-

14 nen um 80% [11]. Weitere Tyrosinkinase Inhibitoren wie

Pazopanib (GlaxoSmithKlein), TG100801 und TG101095

(Targegen) werden für die topische Anwendung entwickelt. Der Wirkstoff AL39324 (Alcon) ist hingegen für die intravitreale Injektion konzipiert.

Der PKC-β Inhibitor (ruboxistaurin mesylate) wurde für die Applikation bei dem diabetischen Makulaödem untersucht, wäre aber auch ein möglicher Kandidat für die AMD-Behandlung. Ähnliches gilt für die Inhibition der C-raf-1-Kinase [4]. iCo-007 (iCo Therapeutics), ein Antisense-Oligonukleotid der 2. Generation, das gegen die C-raf Kinase mRNS gerichtet ist und für die Behandlung neovaskulärer Prozesse entwickelt wurde. iCo-007 bindet an die mRNS für die C-raf-Kinase und unterbindet deren Transkription ähnlich der siRNA. Antisense Oligonukleotide sind im Vergleich zur siRNA instabiler und weniger effektiv. Die zweite Generation dieser Substanzklasse ist jedoch deutlich verbessert worden.

Squalamin (Genaera), ist ein Aminosterol mit antiangiogenen Eigenschaften, das über die Inhibition der intrazellulären Signalkaskade (u. a. von VEGF) wirkt. Nach positiven experimentellen und Phase-I/II-Ergebnissen wurde die Phase III Studie gestoppt.

Eine ganze Reihe von Substanzen, die VEGF-Rezeptor- Kinasen und VEGF-induzierte Effekte inhibieren, werden u. a. auch zur Behandlung der AMD untersucht. Es handelt sich dabei um Quinazolin-Derivate (Astrazeneca AB), Imidazo[1,2-A]Pyridine (Lilly Co.), AnthranilamidePyridinureas (Bayer Schering Pharma AG), Anthranilic Acid Amides und 2-Aminonicotine-Amide (Novartis AG), Thalidomid-Analoga und N-Aryl-Sulfoximine-substituier- te Pyrimidine (Schering AG). Als mögliche weitere Ansatzpunkte gelten neben der VEGF anschließenden Signalkaskade auch weiter oben in dieser Kaskade gelegene Ziele wie mTOR and HIF-α. Hierbei spielt mTOR eine zentrale Schlüsselrolle, da es als Konvergenzpunkt multipler Kaskaden sowohl aktivierende als auch inhibierende Signale reguliert, die auf die Proteinsynthese, die Angiogenese, die Zellproliferation und den Zellmetabolismus einwirken. Momentan befinden sich in der klinischen Erprobung Everolimus (RAD-001, Novartis) und Palomid 529 (Paloma Pharmaceuticals, Inc.).

14.3.4 Natürliche VEGF-Gegenspieler

Die Angiogenese wird von proangiogenen und von antiangiogenen Faktoren gesteuert. So steht das starke proangiogenen VEGF normalerweise im Gleichgewicht zu seinen Gegenspielern. Im Rahmen einer Neovaskularisation ist dieses Gleichgewicht gestört. Eine Strategie dieses Gleichgewicht wieder herzustellen, beruht deshalb auf dem Einsatz von natürlichen Inhibitoren. Zu den bekanntesten antiangiogenen Faktoren gehören PEDF und Endostatin.

Für den »pigment epithelium derived factor« (PEDF) wurde in Phase-I-Studien gezeigt, dass die intravitreale Injektion eines Adenovirus-Vektors, der PEDF exprimiert (AdPEDF, GenVec), die Progression choroidaler Neovaskularisationen reduziert [3]. PEDF reguliert das normale Blutgefäßwachstum und schützt die Photorezeptoren. Die AdPEDF-Therapie könnte daher zusätzlich zur antiangiogenetischen Wirkung eine protektive Wirkung auf die Photorezeptoren haben. Ein weiterer Vorteil könnte sein, dass die Wirkung nach intravitrealer Gabe mehrere Monate anhält.

Endostatin ist ein 20-kD-Fragment des C-Terminus von Kollagen XVIII, das die VEGF-Signalkette auf der Rezeptorebene hemmt. Dieses Molekül inhibiert die Migration von Endothelzellen, hemmt deren Zellzyklus und induziert ihre Apoptose. Im Mausmodel konnten durch