Мистерии сибирской язвы (учебник)

Раздел II • 21. Культура и её свойства

Рис. 21.5. Визуализация капсулы B. anthracis (а – по Котенева Е. А., 2023; b – по Boyer A. E., 2011): а – окраска по Ребигеру; b – окраска по М’Фадьену (MFad);

с – окраска тушью

Существуют и другие способы окраски. Способ Михина́ : метиленовый синий «по Лёффлеру́ »1 наносят на фиксированный мазок и прогревают 2–3 минуты до образования паров, после чего быстро смывают дистиллированной водой (излишки воды вымывают краску из капсулы). В результате бактериальные клетки окрашиваются в тёмно-синий цвет, а капсулы – в светло-розовый. Способ Кауфмана́ : метиленовый синий «по Лёффлеру» наносят на фиксированный мазок на 2–3 минуты и смывают дистиллированной водой. Далее мазок погружают в 0,5%-ный раствор нитрата серебра (или 0,25%- ный водный раствор протаргола) на 3–4 минуты, после чего мазок вынимают и наносят на него карболовый раствор фуксина (в соотношении 1 : 20) на 5–10 секунд, обильно промывают дистиллированной водой и высушивают. В результате бактериальные клетки окрашиваются в тёмно-синий цвет, а капсулы – в тёмно-красный. Способ Ионе́ : на фиксированный мазок наносят 2%-ный водный раствор метилвиолета (или генцианвиолета) и подогревают 1–2 минуты. Затем быстро промывают небольшим количеством дистиллированной воды и обрабатывают 2%-ным водным раствором уксусной кислоты в течение 10 секунд, после чего промывают дистилли-

1 Способ приготовления: растворить 3 г метиленового синего в 2 мг 96%-ного раствора этилового спирта, после чего прилить 1 мл 1%-ного раствора гидроксида калия и 100 мл дистиллированной воды и тщательно перемешать. Приготовленная краска должна созревать несколько месяцев, поэтому для ускорения созревания её заливают в посуду наполовину, закрывая рыхлой ватной пробкой для лучшей аэрации. Созревший раствор устойчивый и может храниться, закрытый стеклянной или резиновой пробкой, несколько лет.

300

Мистерии сибирской язвы

рованной водой и высушивают. В результате бактериальные клетки окрашиваются в тёмно-фиолетовый цвет, а капсулы – в розовофиолетовый. Способ Бурри́ – Гинса́ : на предметное стекло наносят одну каплю туши, в которую вносят бактериальную культуру и дают подсохнуть. Затем мазок фиксируют, высушивают и красят фуксином Пфейффера или метиленовым синим «по Лёффлеру» в течение 5 минут, после чего обильно промывают дистиллированной водой и высушивают. В результате бактериальные клетки окрашиваются в синий цвет, а остаются неокрашенными на чёрном фоне мазка.

Визуализировать вегетативные клетки сибиреязвенного микроба можно также прямым методом флуоресцирующих антител<1>, кото-

рый заключается в нанесении на исследуемый объект конъюгированного (т. е. соединённого) с флюорохромом антитела («люмсыворотка»), специфичного к данному возбудителю. В результате соединения антитела с антигеном под действием облучения коротковолновыми лучами (люминесцентная микроскопия) искомые бактерии будут специфически светиться. Итак, на фиксированные мазки наносят сыворотку (сибиреязвенные люминесцирующие адсорбированные соматические иммуноглобулины2) и помещают в чашку Петри с комочком влажной ваты (так называемая влажная камера), выдерживая 20 минут при 37 °С. Затем дважды тщательно промывают физиологическим раствором (по 10 минут), дистиллированной водой и высушивают. В случае, если мазок готовился из нативного материала, окрашивают смесью равных количеств сыворотки и альбумина, взятых в половине от рабочих разведений.

На окрашенный мазок наносят нелюминесцентное иммерсионное масло (допускается применение смеси физиологического раствора и химически чистого глицерина в соотношении 1 : 3) и микроскопируют с помощью люминесцентного микроскопа. Специфическим считают ярко-зелёное свечение клеточной стенки и капсулы (Рис. 21.6).

1Coons A. H., Kaplan M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. J Exp Med. 1950; 91(1):1–13; DOI: 10.1084/jem.91.1.1.

2При исследовании мазков из клинических материалов, а также культур, выращенных на питательных средах, способствующих капсулообразованию, используют антикапсульные иммуноглобулины.

301

Раздел II • 21. Культура и её свойства

Рис. 21.6. Люминесцентное окрашивание клеточной стенки (А) и капсулы (В) штамма B. anthracis Pasteur (1), а также изолята 2002013601 из окружающей среды (2) и изолята 20020007069 из лёгочной ткани пациента (3), полученных во время Ameritrax (по De B. K., 2002)

Оценку результатов проводят по так называемой системе четырёх крестов:

302

Выявление капсулообразования можно осуществить путём посева нескольких капель исследуемой культуры на сывороточный агар, бикарбонатный агар, бикарбонатно-сывороточный агар, среду Лёффлера, молочно-солевой агар или среду Green’а. Посевы инкубируют при 37 °С в атмосфере СО2. Для этого используют CO2- инкубатор или эксикатор, на дно которого устанавливают зажжённую свечу и накрывают притёртой крышкой (для поддержания горения израсходуется весь кислород, содержащийся в эксикаторе). Уже через полчаса-час инкубации начнётся капсулообразование, которое завершится к 18 часам (Рис. 21.7).

В случае использования среды ГКИ, названной в честь Государственного контрольного института им. Л. А. Тарасевича1, пробирки с посевами закрывают стерильными резиновыми пробками и инкубируют в термостате при 37 °С.

Отсутствие подвижности определяют посевом исследуемой культуры в полужидкий агар (например, LB-агар) в виде прокола (Рис. 21.8)2. Считается, что это важный дифференциальный признак, отличающий сибиреязвенный микроб от других представителей B. cereus complex, однако штаммы, не обладающие подвижностью, среди них всё же встречаются.

1Ныне в составе Научного центра экспертизы средств медицинского применения Министерства здравоохранения Российской Федерации.

2Ряд специалистов предлагает исследовать подвижность микроскопированием «висячей» или раздавленной капли, а также в камере Горяева́ , однако эти методы опасны с точки зрения биологической безопасности и при наличии более безопасного «прокола» видятся нецелесообразными.

303

Мистерии сибирской язвы

скольку сибиреязвенный микроб фосфатазу не продуцирует или продуцирует в незначительном количестве, недостаточном для разложения фенолфталеинфосфата натрия, его колонии не окрасятся (другие почвенные бациллы, как правило, фосфатазу продуцируют).

Определение гемолитической активности. На поверхность кровя-

ного агара или мясопептонного агара (или агара Хоттингера) с 3– 5%-ной дефибринированной бараньей кровью наносят исследуемую культуру, после чего инкубируют при 37 °С в течение суток, за которые сибиреязвенный микроб не способен проявить гемолитическую активность. В дальнейшем гемолитическая активность проявляется (Рис. 21.9). Данный признак принято считать стабильным, однако следует помнить, что изменение состава среды (использование эритроцитов иных животных) может способствовать проявлению гемолитической активности уже на первые сутки. Для штаммов сибиреязвенного микроба характерен β-гемолиз, при котором происходит полный лизис эритроцитов в среде, что визуализируется в виде появления прозрачной зоны вокруг колоний. Однако встречаются штаммы, например, уже знакомый нам штамм Sterne, для которых характерен α-гемолиз, при котором эритроциты лизируются частично с сохранением клеточной стромы, а гемоглобин превращается в метгемоглобин, что проявляется зеленоватым оттенком среды в месте роста бактерий.

Рис. 21.9. Отрицательный (слева) и положительный (справа) тест на гемолитическую активность

305

Раздел II • 21. Культура и её свойства

Исследование на способность разжижать желатин (протеолитическую активность) проводят с помощью желатиновой среды, разлитой в пробирки «столбиком». Посев материала осуществляют проколом среды строго по центру, не доходя одного сантиметра до дна пробирки, после чего инкубируют 24 часа при комнатной температуре, наблюдая при положительной реакции разжижение среды по месту прокола. Если инкубировать посевы при 35–37 °С, то есть при температуре плавления желатина, то после охлаждения при положительной реакции не произойдёт затвердевания. Некоторые штаммы сибиреязвенного микроба проявляют протеолитическую активность.

Для совместного определения гемолитической и протеолитиче-

ской активности используют двухслойный агар, в котором проделывают 6–7 лунок (на дно заливают по капле расплавленного 1%- ного агара). В лунки вносят по 0,1 мл двухсуточной бульонной культуры и инкубируют при 37 °С. Спустя 24 часа для учёта протеолитической активности поверхность агара обрабатывают 20%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, что приводит к появлению зон просветления (Рис. 21.10). Учёт гемолитической активности проводят спустя 48 часов инкубации.

Определение лецитиназной активности. Суточную культуру высе-

вают «бляшкой» или «змейкой» («жирненько») на поверхность мясопептонного агара (или агара Хоттингера) с яичным желтком и инкубируют при 37 °С. Большинство штаммов сибиреязвенного микроба не сворачивают желток, поэтому в течение 2–3 суток вокруг посева не наблюдается мутной белой зоны, хотя встречаются и исключения.

Культуры сибиреязвенного микроба исследуют на чувствительность к пенициллину тестом «жемчужного ожерелья»1. В три пробирки разливают по 10 мл предварительно остуженного до 45 °С 2%-ного питательного агара. В первую и вторую пробирки добавляют соответственно 0,05 и 0,5 ЕД/мл пенициллина, а третью оставляют в качестве контроля. Содержимое пробирок выливают в чашки Петри, размечают на сектора и в каждый сектор вносят по капле исследуемых 3–6-часовых бульонных культур (не более 10), после

1 Об исследовании антибиотикочувствительности поговорим в Главе 24.

306

Мистерии сибирской язвы

чего инкубируют при 37°С в течение 3 часов. Далее на каждый сектор аккуратно помещают покровное стекло и исследуют под иммерсионным маслом. На средах, содержащих пенициллин, клетки сибиреязвенного микроба будут иметь округлую форму, напоминающую жемчужины, как бы собранные в ожерелье за счёт характерного для B. anthracis цепочечного расположения (Рис. 21.11).

Можно видеть, что этот способ достаточно сложен в исполнении с точки зрения обеспечения биологической безопасности, поэтому на практике чаще всего пользуются модификацией по Е. В. Груз. В две пробирки с бульоном Хоттингера (рН 7,2) приливают 20%-ную инактивированную лошадиную сыворотку и соответственно по 0,05 и 0,5 ЕД/мл пенициллина. Содержимое переливают в две пробирки по 2–3 мл, а в третью пробирку – 2–3 мл бульона Хоттингера (контроль). Засевают по две капли исследуемой бульонной культуры или вносят петлёй исследуемую агаровую культуру, после чего инкубируют при 37 °С в течение 3 часов. Далее делают мазки, которые после фиксации окрашивают как при исследовании капсулы (по М’Фадьену, Ребигеру и т. д).

Многие штаммы сибиреязвенного микроба чувствительны к диагностическим бактериофагам, в частности, уже упоминаемому гамма-фагу, а также «К», Fah-ВНИИИВВиМ и другим. Чувствительность культуры к бактериофагам проверяют путём её посева в

307

Раздел II • 21. Культура и её свойства

виде агаровой культуры (или 3–6- часовой бульонной культуры) «сплошным газоном» на чашку, куда затем вносится одна капля бактериофага 1 , после чего чашка инкубируется при 37 °С не менее 6 часов. В случае положительного результата на месте нанесения капли бак-

териофага будет обнаруживаться полное (или частичное) отсутствие роста бактериальной культуры в виде округлого просветления (Рис. 21.12). Следует помнить, что специфичность фагового теста (т. е. отношение полученного результата к истинному результату) составляет всего 97 %, то есть могут быть ложноположительные и ложноотрицательные результаты, поскольку, с одной стороны, имеются штаммы сибиреязвенного микроба, не лизирующиеся диагностическими фагами (в частности, «проникновению» фага может препятствовать капсула), а, с другой стороны, существуют почвенные бактерии, лизирующиеся сибиреязвенными фагами. В частности, при изучении почвенных изолятов выяснилось< 2 >, что чувствительностью к гамма-фагу обладают штаммы, относящиеся не только к B. cereus complex, но и к иным Bacillus spp., Lysinibacillus spp. и Solibacillus silvestris.

Вернёмся к культивированию культур, подлежащих исследованию. Всё это время мы говорили про исследование вегетативных клеток, то есть культур, которые инкубировались примерно сутки, однако если инкубировать 2–5 дней, то в отсутствие питательных

1Некоторые специалисты рекомендуют, слегка приподняв чашку, дать капле стечь, чтобы сформировать так называемую фаговую дорожку.

2Kolton C. B., Podnesky N. L., et al. Bacillus anthracis gamma phage lysis among soil bacteria: an update on test specificity. BMC Res Notes. 2017; 10(1):598; DOI: 10.1186/s13104–017–2919–8.

308

Мистерии сибирской язвы

веществ (их поедания бактериями) на воздухе, как Вы знаете, клетки перейдут в споровое состояние. Исследуют и их.

Для начала готовят мазки, которые фиксируют и окрашивают. Существует большое количество способов окраски, но самая популярная на сегодняшний день – по Цилю́ – Нильсену́ . На фиксированный мазок наносят карболовый фуксин Циля́ 1 и подогревают до образования паров (не доводить до кипения), после чего прогревание прекращают и оставляют мазок на 2–3 минуты. Промывают дистиллированной водой и наносят 5–10%-ный раствор серной кислоты (или 5%-ный раствор азотной кислоты, или 3%-ный раствор соляной кислоты) для обесцвечивания в течение 3–5 секунд (до появления желтоватого оттенка), после чего тщательно промывают дистиллированной водой, ополаскивают 96%-ным раствором этилового спирта в течение 5–10 секунд(2) и снова промывают дистиллированной водой. Наносят метиленовый синий «по Лёффлеру» (или 0,1%-ным раствором малахитового зелёного) на 2–3 минуты, промывают дистиллированной водой и высушивают. В результате бактериальные клетки окрашиваются в синий цвет, а споры – в розовый с интенсивной окраской по периферии (жизнеспособные), в красный (слабо жизнеспособные) или синий (нежизнеспособные). Однако на практике такой картины бывает добиться крайне сложно, особенно начинающим специалистам (Рис. 21.13-b).

В условиях мобильной лаборатории, как и в случае окраски по Граму, целесообразно использовать модификацию по А. И. Синёву. Для этого фильтровальную бумагу пропитывают 2%-ным раствором основного фуксина, сушат и нарезают на полоски, которые хранят в тёмной таре с притёртой пробкой. На фиксированный мазок наносят 2–3 капли дистиллированной воды, накладывают с помощью пинцета полоску, слегка придавливая её к стеклу, и подогревают мазок до появления паров, после чего прогревание пре-

1Способ приготовления: тщательно растереть в ступке 1 г основного фуксина и 5

гфенола (кристаллического) с несколькими каплями глицерина. При этом, постоянно помешивая, по каплям влить 10 мл 95%-ного этилового спирта и 100 мл дистиллированной воды. Выдержать 2–3 суток.

2Вместо кислот и спирта советский врач, бактериолог Никола́й Александрович́ Розанов́ (? – ?) рекомендует использовать смесь, состоящую из 3 мл соляной кислоты и 97 мл 96%-ного раствора этилового спирта.

309