Мистерии сибирской язвы (учебник)

Раздел I • 1. Три вехи истории

эксперименты: берёт мышь и прививает ей селезёнку человека, умершего от Milzbrand (нем. «огонь селезёнки»). «Сначала я делал прививку в ушки или средину хвоста, – пишет<1> Кох, – но нашёл эти методы небезопасными, так как животные могут удалить прививочный материал путём растирания или облизывания. Позже местом прививки я выбрал заднюю часть основания хвоста, где кожа уже подвижна и покрыта длинной шерстью. Для этой цели используется мышь, сидящая в большом стакане, накрытом крышкой, удерживаемая за хвост длинным пинцетом. Хвост выдёргивается из узкой щели между крышкой и краем стакана до такой степени, что можно сделать неглубокий поперечный надрез на коже»2.

Селезёнка заражённой мыши обнаруживается значительно раз-

дутой и наполненной «бесчисленным количеством кристально чи-

стых палочек», которые, хотя и в меньшем количестве, также обнаруживаются в крови. Опытным путём Кох установил, что количество этих палочек в крови зависит от вида животного. Так, в крови морских свинок их количество равно или превышает количество эритроцитов, а в крови кроликов их значительно меньше. В крови же мышей их настолько мало, «что иногда кажется, будто их вовсе нет», и именно этим объясняется то, что оппоненты Казимира Давена умудрялись заражать животных кровью, свободной от этих палочек.

Ранее сообщалось, что они также подвергали сомнению возможность сохранения палочек в крови и указывали на явную сезонность заболевания. Заражая животных последовательно, прививая новой мыши селезёнку предыдущей, Кох пристально изучал выделяемые от них палочки. Он установил, что вопреки сведениям Давена палочки не так устойчивы, и кровь, их содержащая, сохраняет свой заражающий потенциал (инокуляционную способность) «лишь несколько недель в высушенном состоянии и всего несколько дней

1Koch R. Die Ätiologie der Milzbrand-Krankheit, begründet auf die Entwicklungsgeschichte des Bacillus Anthracis, Berlin, 1876, 26 p.

2Сравните приведённое описание с методикой внутривенного заражения лабораторного животного, изложенной в Главе 34 Оперы о чуме (здесь и далее таким

образом будут приводиться ссылки на предыдущую книгу: Горшков-Кантакузен В. А.

Опера о чуме. М.: Издательство Московского университета, 2024, 616 с. ISBN 978–5–19–012018–9; 978–19–012017–2; англоязычная версия: Gorshkov-Cantacuzene V. A. The Opera on the Plague, 2024, 572 p. ISBN 979–8–3507–3905–3).

20

Мистерии сибирской язвы

Микрофотография мазка крови животного (слева), умершего в Хемнице (Германия) в 1878 году (слева любезно предоставлено Dr. Gregor Grass; справа по Braun P., 2020). Препарат (а – общий вид конверта, b – вид препарата) был изготовлен через два года после того, как Роберт Кох выделил чистую культуру возбудителя, и, хотя он значительно пострадал от времени, мы можем видеть, какие бактерии видели Онезим Делафон, Пьер Райе и Казимир Давен

Мазки-отпечатки селезёнки животного, на которых наблюдаются «палочки» в капсуле; окраска генцианвиолетом (слева) и эозином (справа). Конечно, Онезим Делафон, Пьер Райе, Казимир Давен, Аллойс Поллендер и Роберт Кох исследовали неокрашенные препараты, поэтому остаётся лишь восхищаться их наблюдательностью

21

Раздел I • 1. Три вехи истории

Рисунок Роберта Коха, изображающий увиденные им кристально чистые палочки в селезёнке

(любезно предоставлено Robert-Koch-Institut)

22

Мистерии сибирской язвы

во влажном».

Внимательному читателю уже наверняка на ум пришёл вопрос,

которым задался и Кох: так как же такие скоропортящиеся микроорганизмы могли стать возбудителями заболевания, которое часто дремлет всю зиму и, возможно, годами во влажной почве? Ответ на этот во-

прос предложил уже упомянутый Фердинанд Кон: палочки могут переходить в состояние спор, сохраняться в таком виде продолжительное время и затем снова «превращаться» в палочки (вегетатив-

ные клетки). «Все мои дальнейшие попытки, – пишет Кох, – были направлены на обнаружение этого предполагаемого состояния… После многих безуспешных усилий наконец удалось достичь этих целей и таким образом определить истинную этиологию заболевания»,, вызывае-

мого бактериями, отнесёнными< 1 > Фердинандом Коном к роду Bacillus и именуемыми Bacillus anthracis, как называем их мы вплоть до сего дня; заболевания, которое в различных местах носило названия Milzbrand, charbon malin, sang de rate, anthrax (др.-греч. «уголь»), la maladie de Bradford (фр. «болезнь Бредфорда»), Cumberland disease (англ. «болезнь Кимберленда»), болезнь сортировщиков шерсти, карбункул злокачественный и, наконец, сибирская язва.

К настоящему времени она всё ещё остаётся особо опасной болезнью, передающейся от животных к человеку и распространённой в регионах с развитым скотоводством. Её возбудитель, спорообразующая бактерия Bacillus anthracis, способна долгое время сохраняться в окружающей среде, создавая постоянную угрозу возникновения новых вспышек.

Дабы достоверно доказать, что бактерии B. anthracis способны переходить от палочкообразной формы в споровую и обратно, наш пока ещё мало кому известный экспериментатор Роберт Кох про-

1 Cohn F. J. Beiträge zur Biologie der Pflanzen, Bd. II, Heft 2, Breslau: J. U. Kerns Verlag, 1876, 277 p.

23

Раздел I • 2. Мир глазами Коха

Роберт Кох

(любезно предоставлено Robert-Koch-Institut)

24

Мистерии сибирской язвы

водит следующий эксперимент. На предметное стекло он наносит каплю свежей бычьей крови, к которой добавляет небольшой кусочек гомогенизата (т. е. однородной массы) селезёнки, содержащей бактерии, и сверху накрывает покровным стеклом так, чтобы гомогенизат размещался примерно посередине. Во избежание высыхания препарат помещается во влажную камеру(1) и при температуре 35–37 °С инкубируется 15–20 часов.

Кох пишет: В середине препарата между хорошо сохранившимися клетками крови и селезёнки (Рис. 2.1-Fig.1а,b) всё ещё обнаруживается множество неизменных бацилл (т. е. бактерий), но в меньшем количестве, чем в свежем препарате. Однако, как только стоит выйти из середины препарата, тут же встречаются бациллы, что в 3–8 раз длиннее и имеют небольшие изгибы и искривления (Рис. 2.1-Fig.2). Чем ближе подходишь к краю, тем более длинные нити обнаруживаются, многократно перекрученные и превосходящие в длине исходные бациллы в сто и более раз (Рис. 2.1-Fig.3). Многие из этих длинных нитей утратили свою однородную структуру и стеклообразный вид, их содержимое мелко гранулировано, а местами через равные промежутки встречаются мелкие светопреломляющие гранулы (Рис. 2.1-Fig.3a). Их развитие наиболее интенсивно в нитях, расположенных ближе к краю, что, вероятно, более благоприятно для них с точки зрения газообмена в жидком препарате. Они содержат полностью сформировавшиеся споры, внедрённые в вещество нитей в виде несколько вытянутых, круглых, сильно преломляющих свет тел, расположенных через очень короткие регулярные интервалы (Рис. 2.1-Fig.4a). В таком виде эти нити, особенно когда они сгруппированы в многочисленные переплетённые и закрученные линии, представляют собой удивительное зрелище, которое лучше всего сравнить с очень тонкими, искусственно уложенными нитями жемчуга. Некоторые нити уже находятся в процессе распада, и на их преж-

1 «Влажность воздуха во влажной камере необходимо регулировать так, чтобы жидкая часть препарата не просачивалась из-под покровного стекла и не высыхала по его краю. В первом случае бациллы вымываются и ускользают от наблюдения, а во втором блокируются сухим поверхностным слоем, что предотвращает их дальнейшее развитие… Для влажной камеры я использовал плоские тарелки (чашки Петри будут изобретены только через 10 лет. – Примеч. автора), наполненные мокрым песком, а его поверхность устилал фильтровальной бумагой. Тарелка накрывалась стеклянной пластиной. Если слой песка настолько высок, что расстояние между поверхностью образцов и нижней стороной стеклянной пластинки составляет 0,5–1 см, то образцы остаются достаточно влажны-

ми» Роберт Кох.

25

Мистерии сибирской язвы

Рисунок Роберта Коха (черновик к статье), изображающий некоторые иллюстрации с Рис. 2.1 (любезно предоставлено Robert-Koch-Institut)

◄ Рис. 2.1. Иллюстрации опытов Роберта Коха, опубликованные им в статье (по Koch R., 1876): Fig. 1 – бактерии из крови морской свинки, имеющие вид стекловидных палочек (а), некоторые из которых начинают ветвиться и изгибаться (b); Fig. 2 – бактерии из селезёнки мыши после трёхчасвого культивирования в капле чистой водянистой влаги (humor aquosus) бычьей камеры глаза; Fig. 3 – бактерии из Fig. 2 после 10 часов культивирования; Fig. 4 – бактерии из Fig. 2 после 24 часов культивирования; Fig. 5 – прорастание спор; Fig. 6 – предметное стекло, на котором «глазами вы можете увидеть слегка плавающие, чрезвычайно тонкие массы нитей, вросшие в каплю от места посева»; Fig. 7 – результат помещения фрагмента заражённой селезёнки мыши под кожу спины лягушки (а – крупные ядросодержащие бактерии, b – короткие, слегка изогнутые бактерии, объединённые в гроздья и закрученные по спирали, которые продолжают расти и развиваться в клетках, разрывая их; с – разрушение клеточных мембран, g – высвобождение бактерий, е – клетки крови лягушки); Fig. 8–11 – не подписаны автором; Fig.11 запечатлён процесс споруляции

27

Раздел I • 2. Мир глазами Коха

нюю форму указывает лишь расположение спор, все ещё скреплённых вместе слизистым связующим веществом. А кое-где уже встречаются отдельные споры или небольшие скопления слипшихся (агломерированных) спор (Рис. 2.1-Fig.4a).

Несмотря на такую красоту, полученную в одном препарате, и множественные повторения этого эксперимента, всё ещё нельзя исключать вероятность контаминации препарата бактериями из воздуха, ибо «каким образом бациллы, – пишет Кох, – у которых я ранее не замечал никакого самостоятельного движения, смогли добраться до края препарата, тогда как клетки крови остались в его середине?».

Для ответа на этот вопрос он конструирует прибор, состоящий из нагреваемого керосиновой лампой до 40 °С предметного столика1, на котором размещается полое предметное стекло, накрытое покровным стеклом (Рис. 2.1-Fig.6), а сверху водружается микроскоп. На нижнюю сторону покровного стекла помещается капля чистой водянистой влаги (humor aquosus) бычьей камеры глаза, в край которой вносится немного свежего гомогенизата селезёнки, содержащего бактерии, после чего покровное стекло помещают на предметное, покрытое маслом, а затем весь препарат фиксируют на предметном столике и каждые 10–20 минут с помощью микроскопа делают зарисовки.

Кох пишет: Сначала бациллы несколько уплотнились и как бы набухли, но почти не изменялись в течение первых 2 часов. Затем они начали расти. Через 3–4 часа они уже достигли длины в 10–20 раз больше первоначальной, начали изгибаться, вытеснять друг друга или сплетаться в косичку. Ещё через несколько часов отдельные нити стали настолько длинны, что не помещались в одно поле зрения. Они напоминали ворох стеклянных нитей, которые на манер лиан соединяются разнообразными способами, то образуя длинные параллельные пряди, то образуя чрезвычайно тонкие спирально закрученные пучки неправильной формы. Если непрерывно наблюдать за свободным концом нити в течение длительного времени, например, минут 15 или 20, то можно легко заметить непрерывное удлинение нити и, таким образом, стать свидетелем странного зрелища видимого роста бацилл и удивиться в их

1 Для точного определения температуры Роберт Кох использовал каплю говяжьего жира, расплавляющегося при данной температуре.

28

Мистерии сибирской язвы

дальнейшем развитии. Уже через 10–15 часов содержимое самых сильных и пышно разросшихся нитей становится мелко гранулированным и вскоре через равные промежутки отделяются очень мелкие, матово блестящие гранулы, которые ещё через несколько часов увеличиваются и образуют сильно преломляющие свет споры. Постепенно нити распадаются и крошатся на концах, споры становятся свободными и, следуя закону гравитации, опускаются в нижние слои капли, где скапливаются в плотные кучки. В таком состоянии препарат остаётся в течение нескольких недель.

Конечно, описанное Кох видел не в одном препарате, а в многочисленной серии опытов, но он наглядно продемонстрировал возможность споруляции (т. е. спорообразования) вегетативной клетки возбудителя сибирской язвы1 под действием таких факторов, как обеднение питательной среды (в результате культивирования бактерии потребляли питательные вещества из субстрата), действие растворённого кислорода, которого с краю препарата было больше, чем посередине, а также сниженное содержание углекислого газа2. Другими немаловажными факторами являются температура и наличие солнечного света. О первой Кох сообщает, что спорообразование возможно при температурах от 12 до 45 °С, но наилучшее спорообразование возможно при 35 °С. О влиянии света он ничего не сообщает, но можно предположить, что, поскольку свои опыты Кох проводил дома, в одной из комнат, переделанной под лабораторию, солнечного света в помещении было достаточно3.

1Поскольку речь идёт о клетках, обнаруженных в тканях заражённых животных,

свысокой долей вероятности можно утверждать, что Кох видел капсульную форму. Конечно, он мог работать с редкими бескапсульными штаммами, однако он также сообщает, что наблюдал «очень мелкие матово блестящие гранулы». Таким образом,

Кох видел не просто процесс перехода вегетативной клетки в спору, а последовательность: капсульная форма – вегетативная форма – размножение цепочками – капсульная форма – споруляция.

2Имеются сведения, что изменение концентрации кислорода не так сильно влияет на возможность споруляции, как концентрация CO2, возрастание которой зна-

чительно затрудняет этот процесс (см. Infection disease of animals, disease due to bacteria, Vol.1, Ed.: Stableforth A. W., Galloway I. A., London: Butterworth, 1959).

3Для улучшения споруляции в практической работе некоторые специалисты предпочитают выставлять посуду с выращенной культурой (чашки и флаконы) на поверхности, обеспечивающие попадание прямых солнечных лучей. Однако не следует при этом забывать о правилах биологической безопасности.

29