Мистерии сибирской язвы (учебник)

Раздел I • 4. Штаммы из Кот-д’Ивуара и Камеруна

Рис. 4.2. Признаки кортикального сидероза, выявленные с помощью количественной магнитно-резонансной томографии (а; R2* – эффективная скорость поперечной релаксации) и на гистологическом срезе (b); окраска по Перльсу (bи с), по Нисслю (d и е). На R2*(а) можно видеть гиперинтенсивный двухполосный ободок (стрелки), идущий параллельно поверхности мозга, что указывает на «утечку» железа в ткань, что подтверждается гистологическими срезами (b; стрелки). Причём характерные полосы визуализируются как при окраске по Перльсу на железо (с), так и по Нисслю (d), а при большем увеличении (е) можно видеть поверхностный кортикальный сидероз с тёмными гранулами в кортикальном слое I

и II (по Gräßle T., 2024)

60

Мистерии сибирской язвы

Похожая история, вероятно, произошла<1> и в Заповеднике фауны Джа (Dja Faunal Reserve), Камерун, где в период с декабря 2004 года по январь 2005 года на территории 35 км2 (северная граница заповедника и прилегающий к нему лес Минкебе) были обнаружены останки трёх шимпанзе (Pan troglodytes troglodytes) и одной западной равнинной гориллы (Gorilla gorilla gorilla), положительные на генетические маркеры сибиреязвенного микроба.

В обоих случаях выдвигалась гипотеза, что B. anthracis проник на территории парка и заповедника с заражённой пищей. При этом хотя речь и идёт о различных штаммах – штамм CI (Кот-д’Ивуар) и штамм CA (Камерун), – они образуют отдельную линию F (лесная сибирская язва), поскольку сильно отличаются от «классических» B. anthracis<2>. В частности, их хромосома лишена четырёх профаговых областей и однонуклеотидной мутации гена plcR, а на плазмиде имеются мутации в генах pag и cya.

Микробиологическое исследование также выявило ряд отличий. К концу первых суток инкубирования при 37 °С бактерии, как и сибиреязвенные, формировали колонии 5 мм в диаметре с характерной «гривой льва» (завиткообразными выступами по краю)(3) и синтезировали капсулу, однако к концу вторых суток колонии уже имели нехарактерный диаметр 10 мм с гладким, блестящим слизистым жёлто-зеленоватым центром (диаметр >5 мм) и сухим, серым, слабо зазубренным краем. Электронная микроскопия отдельных клеток не выявила значительных отличий в морфологии с «классическими» B. anthracis (Рис. 4.4), за исключением наличия небольшого количества жгутиков, обеспечивающих подвижность. Кроме того, культуры устойчивы к диагностическому γ-фагу и синтезируют дополнительную капсулу из гиалуроновой кислоты в виде тонких нитей однородной плотности, окружающих поверхность бактерии (Рис. 4.5). Дальнейшие исследования<4> штаммов показали их

1Leendertz F. H., Lankester F., et al. Anthrax in Western and Central African great apes. Am J Primatol. 2006; 68(9):928–933; DOI: 10.1002/ajp.20298.

2Leendertz F. H., Yumlu S., et al. A New Bacillus anthracis Found in Wild Chimpanzees and a Gorilla from West and Central Africa. PLoS Pathog. 2006; 2(1):e8; DOI: 10.1371/journal.ppat.0020008.

3В англоязычных странах используют термин Medusa head («голова медузы»).

4Klee S. R., Özel M., et al. Characterization of Bacillus anthracis-Like Bacteria Isolated from Wild Great

Apes from Côte d'Ivoire and Cameroon. J Bacteriol. 2006; 188(15):5333–5344; DOI: 10.1128/JB.00303–06; Klee S. R., Brzuszkiewicz E., et al. The genome of a Bacillus isolate causing Anthrax in chimpanzees combines

61

Раздел I • 4. Штаммы из Кот-д’Ивуара и Камеруна

chromosomal properties of B. cereus with B. anthracis virulence plasmids. PLoS One. 2010; 5(7):e10986; DOI: 10.1371/journal.pone.0010986.

62

Мистерии сибирской язвы

◄ Рис. 4.3. Признаки инвазии возбудителя в паренхиму; количественная маг- нитно-резонансная томография патологического состояния (среднее) в сравнении с контролем (верхнее); параметры: MTsat – насыщение переноса намагниченности, R1 – скорость продольной релаксации; окраска по Нисслю (нижнее). Можно видеть признаки гетеролитического повреждения в глубоком белом веществе (белые стрелки), выраженные заполненными жидкостью полостями из-за высокой бактериальной нагрузки, а также на поверхности мозга (жёлтые стрелки). На гистологическом исследовании коры головного мозга (левое нижнее) и белого вещества (среднее нижнее) можно видеть внутрисосудистое (красные стрелки) и паренхиматозное (зелёные стрелки) бактериальное присутствие

(по Gräßle T., 2024)

Рис. 4.4. Морфология бактерий, выделенных от обезьян (левый столбик), в сравнении с «класси-

ческими» B. anthracis

(правый столбик); сканирующая (А – F)

и трансмиссионная (G и H) электронная микроскопия (по Klee S. R., 2006; публику-

ется по лицензии the American Society for Microbiology; разре-

шение передано через the Copyright Clearance Center, Inc.).

Сравните их между собой, а также

Рис. 2.8

63

Раздел I • 4. Штаммы из Кот-д’Ивуара и Камеруна

бóльшее генетическое отличие от сибиреязвенного микроба. Так, например, штамм CI, помимо плазмид рВСХО1 (ранее pCIXO1) и рВСХО2 (ранее pCI-XO2), соответственно на 99 и 100 % идентичных плазмидам сибиреязвенного микроба, может дополнительно содержать плазмиду pCI-14, аналогов которой пока

не обнаружено в бактериальном мире и функции которой пока не ясны. Вместе с тем в данном случае важнее сам факт её наличия, поскольку наличие дополнительных плазмид считается характерной чертой ближайших родственников сибиреязвенного микроба, а не его (изолятов B. anthracis, содержащих третью плазмиду, пока не обнаружено). Интересно ещё и то, что синтез капсулы из гиалуроновой кислоты кодируется опероном hasABC, расположенном на плазмиде рВСХО1, и регулируется геном atxA (т. е. тем, что регулирует синтез и капсулы PDGA), поэтому потеря плазмиды рВСХО2 не снижает вирулентность (например, для мышей и морских свинок), чего не скажешь о сибиреязвенном микробе, вирулентность которого значительно снижается с потерей плазмиды рХО2. Более того, наличие капсулы из гиалуроновой кислоты значительно повышает эффективность инвазии (Рис. 4.6). При этом хотя ген hasA, отвечающий за синтез гиалуроновой кислоты, и имеется у B. anthracis, он содержит делецию, ввиду чего синтез прекращается до капсулообразования.

Хромосома штаммов также преподносит сюрпризы. Она включает шесть уникальных геномных островов (только для острова V имеется соответствующая область у B. cereus AH820). Остров IV особенно интересен тем, что он, располагаясь в гене sigK (кодирует фактор споруляции σК), содержит систему модификациирестрикции I типа, защищающую бактерию от чужеродной ДНК

64

Мистерии сибирской язвы

(например, ДНК бактериофага). Вполне вероятно, что это способствует более эффективной споруляции, потому что, например, у B. subtilis споруляция менее эффективна, а ген sigK оборван именно профаговой областью.

Также на хромосоме расположено десять генов, связанных с подвижностью, аналогичных таковым у B. anthra cis. Однако в отличие от последнего в них отсутствует мутация сдвига рамки считывания, то есть гены функциональны, что и объясняет подвижность. Более того, как и у штамма B. thuringiensis ser. konkukian 97–27 (изолирован в мае 1995 года<1> от человека с тяжёлым некрозом тканей)(2), имеется два гена (fliC1 и fliC2), ответственных за синтез флагеллина, участвующего в формировании жгутиков. При этом у B. cereus таких генов четыре, а у B. anthracis – всего один.

Определённый интерес представляют гены устойчивости к мерсацидину3, которые обнаруживаются лишь у некоторых штаммов B. cereus, а также гены системы секреции, в частности локус secA2. Дело в том, что он организован точно так же, как аналогичный локус у сибиреязвенного микроба, однако выше него геном организован как у штаммов B. thuringiensis и большинства штаммов B. cereus, а расположенные ниже области, ответственные за синтез белков S- слоя, – как у B. cereus.

Всё это говорит об эволюционном положении этих штаммов не как линии F в рамках внутривидовой филогении B. anthracis, как предполагалось ранее, а как «самостоятельных» штаммов, чьё положение определяется между B. cereus и B. anthracis. Сложно ска-

1Hernandez E., Ramisse F., et al. Bacillus thuringiensis subsp. konkukian (serotype H34) superinfection: Case report and experimental evidence of pathogenicity in immunosuppressed mice. J Clin Microbiol. 1998; 36(7):2138–2139; DOI: 10.1128/jcm.36.7.2138–2139.1998.

2Примечательно, что хотя визуально в спорулирующей культуре фиксировалось наличие кристаллов Bt-токсина, на хромосоме и единственной плазмиде рBT9727 этого штамма отсутствуют гены, кодирующие его синтез, и вполне вероятно, что штамм произошёл от предков линии anthracis.

3Пептидный антибиотик, содержащий бета-метиллантионин и синтезируемый некоторыми представителями рода Basillus. Проявляет активность против грамположительных микроорганизмов, включая метициллин-резистентный золотистый

стафилококк (см. Shatterjee S., Shatterjee S., et al. Mersacidin, a new antibiotic from Bacillus. Fermentation, isolation, purification and chemical characterization. J Antibiot (Tokyo). 1992; 45(6):832–838; DOI:

10.7164/antibiotics.45.832).

65

Раздел I • 4. Штаммы из Кот-д’Ивуара и Камеруна

Рис. 4.6. Развитие инфекционного процесса при интраназальном введении спор биолюминесцентных производных штамма из Камеруна (СА): А – штамм синтезирует только капсулу из гиалуроновой кислоты (1 х 108 спор); В – штамм синтезирует токсины и обе капсулы (1 х 106 спор); С – штамм синтезирует только обе капсулы (1 х 106 спор); мышиная модель; окраска гематоксилинэозином (Ad и d) и по Граму (Ас и е). Можно видеть, что в случае инфицирования штаммом, синтезирующим токсины и обе капсулы (В), инфекционный процесс начинается в носоглотке и распространяется в дренирующий шейный лимфатический узел (D2), а затем в селезёнку и лёгкие непосредственно перед смертью (не показано), тогда как в случае инфицирования штаммом, синтезирующим только обе капсулы, имеет место системное распространение. В случае ►

66

Мистерии сибирской язвы

зать, как образовались эти штаммы, но принято считать (с определённой достоверностью), что B. cereus приобрёл плазмиды в результате горизонтального переноса при прямом контакте (конъюгация) с B. anthracis во время коинфекции животного или в почве(1), что выделяет эти штаммы в особый подвид B. cereus bv. anthracis (Bcbva). Недавние исследования< 2 > показывают, что споры Bcbva (B. cereus bv. anthracis) обнаруживаются в останках дымчатых манго-

беев (Cercocebus atys) и королевских колобусов (Colobus polykomos),

павших в парке Таи (Кот-д’Ивуар), а также от горилл, слонов, козлов, мангустовых, обыкновенных шимпанзе (Pan troglodytes) и падальных мух (Calliphoridae), что доказывает вовлечённость последних в распространение возбудителя. Причём останки одного дымчатого мангобея из парка Таи относятся к периоду с мая 1993 по август 1994 года, то есть за семь лет до описанных событий, и свидетельствуют, что штаммы Bcbva циркулировали уже в это время.

◄ инфицирования штаммом, синтезирующим только капсулу из гиалуроновой кислоты (А), инфекционный процесс ограничивается областью головы и к 6 дню бактерии обнаруживаются в головном мозге (а), исследование тканей которого обнаруживает (b) диффузное воспалительное поражение мягкой и паутинной мозговых оболочек (лептоменингит, LM), мультифокально распространяющееся на паренхиму мозга (звёздочки), а также (с) большое скопление бактерий как в месте воспаления, так и пространствах Вирхова-Робина (т. е. щелевидных пространствах, окружающих сосуды головного мозга). Это поражение также характеризуется (d) множественными кровоизлияниями, отёком и выраженной инфильтрацией нейтрофилов, наличием растяжения (е) мягкой и паутинной оболочек, распространяющегося на мозговую паренхиму с присутствием бактерий в нейропиле (т. е. скоплении отростков нервных клеток; наконечник стрелки), что в значительной степени указывает на многоочаговый разрыв или изменение проницаемости гематоэнцефалического барьера. Таким образом, можно видеть существенный вклад капсулы из гиалуроновой кислоты в локальное размножение бак-

терий (по Brézillon С., 2015)

1 Было показано экспериментально на примере ризосферы (т. е. узкого слоя земли, прилегающего к растениям), в которой при сокультивированиии произошла «передача» плазмиды устойчивости к тетрациклину рВС16 от одного штамма сиби-

реязвенного микроба другому (см. Saile E., Koehler T. M. Bacillus anthracis multiplication, persistence, and genetic exchange in the rhizosphere of grass plants. Appl Environ Microbiol. 2006; 72(5):3168–3174;

DOI: 10.1128/AEM.72.5.3168–3174.2006).

2 Norris M. H., Zincke D., et al. Genomic and phylogenetic analysis of Bacillus cereus biovar anthracis isolated from archival bone samples reveals earlier natural history of the pathogen. Pathogens 2023; 12(8):1065; DOI: 10.3390/pathogens12081065.

67

Раздел I • 4. Штаммы из Кот-д’Ивуара и Камеруна

Интересно, что хотя инфицирования людей и не зарегистрировано, антитела к Bcbva обнаруживаются у 10 % лиц, живущих вблизи Национального парка Таи (вполне вероятно, что инфекция протекала латентно).

Нельзя не сказать пару слов о штамме B. cereus JF3964, изолированном от крупного рогатого скота, умершего в Коза (Камерун), и первоначально выделенном<1> в кластер D1 в рамках внутривидовой таксономии B. anthracis. Однако, несмотря на присутствие плазмид рВСХО1 и рВСХО2, в его геноме отсутствует хромосомный маркер Ba813, характерный для Bcbva и B. anthracis, что генетически «ставит» его между ними< 2 >. Ещё одним таким «промежуточным» штаммом является B. cereus ISP3191, изолированный из пищи (специи) в Бельгии. Интересно, что хотя он не имеет плазмиды рВСХО1 (рХО1) и рВСХО2 (рХО2), его единственная плазмида содержит многие гены плазмиды рХО1 и некоторые гены рХО2.

Рассматривая хромосому «классического» сибиреязвенного микроба в предыдущей главе, мы уже отмечали её схожесть с близкородственными видами, а сейчас познакомились со штаммами B. cereus bv. anthracis, имеющими плазмиды, почти идентичные сибиреязвенным. Но это не единичные случаи. Так, штамм B. cereus G9241, выделенный в 1994 году в штате Луизиана (США) от сварщика с симптомами ингаляционной сибирской язвы (сибиреязвенной пневмонии сварщиков), имеет плазмиды рВСХО1 и рВС210 (ранее рВС218)(3), причём первая плазмида на 99,6 % идентична плазмиде рХО1 сибиреязвенного микроба, а вторая кодирует синтез экзополисахаридной капсулы, а также токсинов, чья аминокислотная последовательность на 36 и 60 % сходна соответственно с летальным фактором и протективным антигеном B. anthracis (в литературе его

1Pilo P., Rossano A., et al. Bovine Bacillus anthracis in Cameroon. Appl Environ Microbiol. 2011; 77(16):5818–5821. doi: 10.1128/AEM.00074–11.

2Antonation K. S., Grūtzmacher K., et al. Bacillus cereus biovar anthracis causing Anthrax in SubSaharan Africa – chromosomal monophyly and broad geographic distribution. PLoS Negl Trop Dis. 2016; 10(9):e0004923; DOI: 10.1371/journal.pntd.0004923.

3Разница в названии связана с тем, что первоначально размер плазмиды был определён как 218 Кб, что и послужило основанием для названия «рВС218». Однако последующие исследования показали, что её размер составляет 210 Кб, ввиду чего

название было изменено на «рВС210» (см. Hoffmaster A. R., Ravel J., et al. Identification of anthrax toxin genes in a Bacillus cereus associated with an illness resembling inhalation anthrax. PNAS. 2004;

101(22):8449–8454; DOI: 10.1073/pnas.0402414101).

68

Мистерии сибирской язвы

иногда именуют certhrax). Кроме того, она несёт гены atxA2 и pagA2, получившие своё название из-за способности кодировать синтез белка, подобного протективно-

му антигену B. anthracis

(напомним: кодируется геном pagA). В геноме присутствует ещё и третий внехромосомный элемент – линейная плазмида рBFH_1

(ранее pBClin29), не-

сущая гены профага, индуцируемые действием температуры, то есть культивирование при 37 °С (температура млекопитающего) инициирует сборку вирионов, причём только в субкультурах, ввиду чего первых можно обнаружить в культуральной жидкости

(Рис. 4.7).

Удивительной особенностью этого штамма является то, что, несмотря на наличие сибиреязвенного токсина (причём в том или ином виде кодируемого генами сразу двух плазмид!), подвижность, толстую капсулу и способность вызывать лёгочную инфекцию у людей (преимущественно сварщиков1), он оказывается авирулентным для новозеландских белых кроликов при подкожном введе-

1 Поскольку болезнь встречается только у сварщиков, нельзя исключать вклад повреждения лёгких, связанного с профессиональной деятельностью. По крайней мере имеются сведения, что сварщики в целом более подвержены респираторным

заболеваниям, чем остальные группы населения (см. Marongiu A., Hasan O., et al. Are welders more at risk of respiratory infections? Findings from a cross-sectional survey and analysis of medical records in shipyard workers: the WELSHIP project. Thorax. 2016; 71(7):601–606; DOI: 10.1136/thoraxjnl-2015–

207912). Косвенным подтверждением этой мысли может служить клинический случай, произошедший в штате Техас (США) в 2011 году, когда штамм B. cereus Elc2, содержащий только одну плазмиду рВСХО1, привёл к лёгочной форме и летально-

му исходу у 39-летнего мужчины, занимающегося дома сваркой (см. Wright A. M., Beres S.B., et al. Rapidly progressive, fatal, inhalation Anthrax-like infection in a human: case report, pathogen genome sequencing, pathology, and coordinated response. Arch Pathol Lab Med. 2011; 135(11): 1447–1459; DOI:

10.5858/2011–0362-SAIR.1).

69