Мистерии сибирской язвы (учебник)

Раздел I • 3. Внутренний мир и эволюция

Мистерии сибирской язвы

тельно усложнится, если Вы сначала размотаете плёнку с одной бобины, а затем будете накручивать на другую. В процессе намотки она попросту перепутается. Однако если Вы будете одновременно крутить бобины, плёнка легко и быстро перемотается с одной на другую.

Плазмида рХО2 была открыта двумя независимыми группами в 1985 году<1> и получила название рХО2. Её размеры варьируются от 94 до 96 Кб. Плазмида имеет 85 ORF, но наибольший интерес представляет оперон capBCАD, обеспечивающий капсулообразование, а также регуляторные гены aspA и aspB, которые косвенно регулируются геном atxA, расположенным на плазмиде рХО1 в ответ на увеличение содержания CO2 и бикарбоната(2). Синтезируемая действием генов capB, capC и capA оперона капсула состоит из анионного полимера γ-связанных остатков D-глутаминовой кислоты, то есть поли-γ-D-глутамата (PDGA). Она ковалентно связана с пептидогликаном клеточной стенки (проходя через S-слой; Рис. 2.8-В), что обеспечивается ферментом CapD, кодируемым геном capD оперона3.

◄ Рис. 3.2. Карта плотности видов сбоку (А) и сверху (В), молекулярная модель вида сбоку (С) и боковой разрез (D) поры, сформированной протективным антигеном, а также схема (Е) транслокации белка (розовый) через пору и его взаимодействие с α-зажимом (жёлтый) в воронке (Funnel) поры, и Ф-зажимом (рыжий),

изажимом заряда (красный) в β-стволе (Channel) поры (по Machen A. J., 2021)

1Green B. D., Battisti L., et al. Demonstration of a capsule plasmid in Bacillus anthracis. Infect Immun. 1985; 49(2):291–297; DOI: 10.1128/iai.49.2.291–297.1985; Uchid I., Sekizaki T., et al. Association of the encapsulation of Bacillus anthracis with a 60 megadalton plasmid. J Gen Microbiol. 1985; 131:363–367.

2Опосредованно он также активирует хромосомный ген eag, кодирующий синтез экстрагируемого антигена 1 (ЕА 1) S-слоя. В предыдущей главе мы говорили, что S-слой состоит из двух взаимозаменяемых белков, существование которых связано с фазой роста бактерии. Таким образом, в ответ на повышение концентрации СО2 синтезируется ЕА1, что характерно для стационарной фазы роста, тогда как при снижении концентрации СО2 активируется хромосомный ген sap, кодирующий синтез поверхностного белка массива (Sap), что характерно для прорастания клетки

иделения её вегетативной формы. Также в формировании S-слоя принимают участие белки, кодируемые генами bslA, bslB и amiA. Первый ген, расположенный на плазмиде рХО1, кодирует белок адгезии, а второй и третий гены, расположенные на плазмидах рХО1и рХО2 соответственно, синтезируют белки, чья функция пока не установлена.

3Ранее белок именовался Dep, а ген, его кодирующий, – dep. Эти названия всё ещё можно встретить в научной литературе.

51

Раздел I • 3. Внутренний мир и эволюция

Этот фермент, расположенный на поверхности пептидогликана, за счёт расщепления пептидной связи серин-треонин в позициях 351 и 32 (пишут: Ser351–Thr352) и, соответственно, высвобождения N- концевой аминогруппы Thr352 обеспечивает захват поли-γ- глутаматных цепей капсулы (реакция транспептидации), словно якорем притягивая её к поверхности клеточной стенки. Следовательно, невозможность синтеза фермента значительно снижает вирулентность штамма, что было показано<1> в опыте на мышах.

Помимо защитной функции, капсула сигнализирует преспоре о возможности сбора летального и отёчного токсинов через формирование лиганда, блокирующего переход преспоры в спору под действием снижения рН. К моменту, когда токсины соберутся, рН будет уже настолько низким, что лиганд разрушится.

Хромосома сибиреязвенного микроба имеет размеры около 5,2– 5,3 Мб. Из множества расположенных на ней генов лишь немногие позволяют отличить B. anthracis от ближайших родственников, таких как, например, B. cereus и B. thuringiensis. «Общими», в частности, являются гены, обеспечивающие спорообразование, а некоторые гены, ранее считавшиеся специфичными для сибиреязвенного микроба (гены BA813, gyrA, gyrB и rpoB), позднее были обнаружены у некоторых штаммов B. cereus, что в значительной степени затрудняет молекулярно-генетическую диагностику, приводя к ложноположительным результатам. С другой стороны, наличие мутации в «общих» генах хотя и может быть использовано для дифференцировки, всё же затруднено в рутинной практике2 ввиду единичности этих мутаций. Например, ген plcR, который в случае B. anthracis содержит однонуклеотидную мутацию (вставка тимина в позиции 640), инактивирующую его, поэтому вплоть до настоящего дня продолжается поиск хромосомных маркеров, специфичных исключительно для сибиреязвенного микроба.

1Candela T., Fouet A. Bacillus anthracis CapD, belonging to the gamma-glutamyltranspeptidase family, is required for the covalent anchoring of capsule to peptidoglycan. Mol Microbiol. 2005; 57(3):717–726; DOI: 10.1111/j.1365–2958.2005.04718.x.

2Конечно, никто не отменяет «золотой стандарт» – выделение чистой культуры на чашке Петри и её последующее исследование (подвижность, гемолитическая активность и т. д.), однако эти методики занимают продолжительное время в отличие от молекулярно-генетических методов (читайте о них в Главе 25).

52

Мистерии сибирской язвы

Среди уникальных хромосомных генов B. anthracis достаточный интерес представляет область ВА1693-ВА1699, гипотетически кодирующая белки, принадлежащие к семейству гликозилтрансфераз, то есть ферментов, катализирующих перенос остатков моносахаридов от углерода-акцептора на молекулу-донора. В частности, исследование<1> белка, кодируемого геном ВА1698, показало его взаимодействие с ферментами синтеза гликогена и с УДФ-глюкозо-6- дегидрогеназы, то есть ген играет роль, соответственно, в накоплении энергии, в синтезе основных полисахаридов, формирующих клеточную стенку, а также в синтезе капсулы.

Также на хромосоме располагаются четыре уникальные области, сформированные профагами 2 . Так, в области, являющейся γ- подобным профагом λBa02, располагается ген, кодирующий эндолизин PlyL, который имеет высокую степень сходства с эндолизином PlyG гамма-бактериофага, лизирующего клеточную стенку сибиреязвенного микроба и некоторых представителей рода Bacillus. В области, являющейся γ-подобным профагом λBa03, располагается ген, кодирующий белок ВА4079, который похож на рецепторсвязывающие белки γ-бактериофагов, обеспечивающий связывание с клеточной стенкой B. anthracis. Примечательной особенностью этого белка является термостабильность, поскольку он не теряет своих функций даже при инкубации при 98 °С, то есть температуре инактивации (гибели) вегетативных клеток. Дают ли эти белки ка- кое-то дополнительное преимущество бактерии, пока неизвестно.

Говоря о внутривидовом разнообразии, следует констатировать, что геном сибиреязвенного микроба является суперконсервативным, то есть возбудитель является мономорфным видом, чему способствует его длительное сохранение в виде споры, иногда достига-

1Zorigt T., Furuta Y., et al. Pan-genome analysis reveals novel chromosomal markers for multiplex PCR-based specific detection of Bacillus anthracis. BMC Infect Dis. 2024; 24:942; DOI: 10.1186/s12879–024–09817–9.

2Бактериофаги (фаги) или вирусы бактерий подразделяются на вирулентные и умеренные. Первые в результате своего жизненного цикла производят новые копии внутри бактериальной клетки и чаще всего вызывают разрушение её стенки, то есть реализуют литический цикл, в связи с чем их также называют литическими. Вторые «живут» в бактерии в виде генетической информации, чаще всего встраиваясь в её геном (такое состояние принято называть профагом), то есть реализуют лизогенный цикл, однако при наступлении «тяжёлых времён» они могут перейти к реализации литического цикла.

53

Раздел I • 3. Внутренний мир и эволюция

ющее десятилетий и, вероятно, столетий, что, следовательно, снижает условное среднее количество циклов репликации генома в год и относительную скорость его эволюции. Эта мысль также подтверждается определением так называемого пангеномного статуса, показывающего возможность обнаружения новых уникальных генов возбудителя при секвенировании его новых штаммов. Статус определяется через закономерность, описываемую< 1 > эмпирическим законом Хипса (Heaps’ law)2:

n = kNγ,

где n – количество генов, N – количество геномов, k –количество уникальных генов при рассмотрении одного генома, γ – скорость, с которой добавляются новые гены по мере включения дополнительных геномов.

Интересно, что данный закон «перекочевал» из лингвистики, где с его помощью описывается распределение уникальных слов в одном документе относительно других, поскольку ведь и геном по сути – это набор «слов»-генов. Если γ стремится к единице (то есть количество уникальных «слов»-генов значительно увеличивается по мере секвенирования новых штаммов), следует говорить об открытом пангеноме, тогда как в противоположной ситуации – о закрытом. Исследования<3> показывают, что B. anthracis имеет закрытый пангеном (γ = 0,09), чего не скажешь о его ближайших родственни-

ках, например, B. cereus (γ = 0,51) и B. thuringiensis (γ = 0,52).

Понимание внутривидовой таксономии сибиреязвенного микроба крайне важно, поскольку возбудитель всё же эволюционирует (несмотря на присущую ему мономорфность) и к настоящему моменту, преимущественно торговыми путями, распространён почти по всему земному шару (за исключением Антарктиды и некоторых островов). При этом определение его «национальности» представляет собой не только сугубо научный интерес, но и основу санитарной охраны. На основе анализа 14 так называемых «канонических»

1Tettelin H., Riley D., et al. Comparative genomics: the bacterial pan-genome. Curr Opin Microbiol. 2008; 11(5):472–277; DOI: 10.1016/j.mib.2008.09.006.

2Назван в честь Гарольда Стэнли Хипса (Harold Stanley Heaps), но в действительности открыт Густавом Герданом (Gustav Herdan) в 1960 году, поэтому иногда именуется «законом Хипса – Гердана» (Herdan-Heaps’ law).

3Zorigt T., Furuta Y., et al. Pan-genome analysis reveals novel chromosomal markers for multiplex PCR-based specific detection of Bacillus anthracis. BMC Infect Dis. 2024; 24:942; DOI: 10.1186/s12879–024–09817–9.

54

Мистерии сибирской язвы

однонуклеотидных полиморфизмов (canSNP; от англ. canonical single nucleotide polymorphism) все штаммы B. anthracis принято подразделять на три эволюционные линии (А, В и С), которые, в свою очередь, подразделяются на подлинии или группы (Рис. 3.3 и

Рис.3.4).

Линия А наиболее генетически разнообразна. Африканская canSNP-группа A.Br.005/006 традиционно считается самой древней, от которой отделилась группа A.Br.Vollum, чьи штаммы обнаруживаются в Иране, Пакистане и Афганистане (реже в Туркменистане, Таджикистане, США и Европе). Далее отделилась группа A.Br.008/009, которая из-за весьма успешного распространения в Азии и Европе получила название TEA (от англ. Trans-Eurasian). Штаммы этой группы широко распространены в России, а также выделяются в Японии, Китае и США. От неё произошли: группа A.Br.008/011, штаммы которой выделяются в России, Словакии, Греции и Китае (подгруппа Tsiankovskii), Западной Сибири и Грузии (подгруппа STI); группа A.Br.011/009, штаммы которой выделяются в районе Абруццо (Италия), Франции и от героиновых наркоманов1 ; а также группа A.Br.WNA, штаммы которой были завезены в Северную Америку, и кластер групп Ва.А0362, Ва.А0417, Ва.А0324 и Sverd.7RA93.15.15, причём последняя группа данного кластера образована штаммом, приведшим к гибели людей в 1979 году во время аварии на военном объекте Свердловск-19 (СССР)2.

Также выделяют группы A.Br.003/004, A.Br.001/002, A.Br.005/006 и A.Br.Aust94. Штаммы первой группы распространены в Южной Америке (меньше в Европе и США), а также ЮАР (подгруппа A.Br.172), Зимбабве и Мозамбике (подгруппа A.Br.102). Штаммы

1Ранее относились к подруппе Heroin группы A.Br.008/011, что ещё можно встретить в научной литературе. Распространение этих штаммов связано с путями нелегальной транспортировки героина, поэтому они встречаются в Европе, странах СНГ, Турции, Афганистане, Индии, Бангладеше, Иране. Особенности клинического течения при инфицировании этими штаммами рассмотрим в Главе 13.

2Эта трагедия как пример пренебрежения правилами биобезопасности уже упоминалась в Главе 27 Оперы о чуме, но мы её дополнительно ещё рассмотрим в Главах 12 и 14. Штамм Anthrax836, о котором идёт речь, был выделен от грызуна в 1956 году в городе Кирове (СССР). Имеются сведения, что он возник в результате утечки в канализацию менее вирулентного штамма по причине неисправности ферментёра, из-за чего, несмотря на проводимую дезинфекцию, имели случаи заражения сибирской язвой грызунов.

55

Мистерии сибирской язвы

Рис. 3.4. Глобальное распространение основных canSNP-групп B. anthracis по данным на 2007 год (по Van Ert M. N., 2007). Следует понимать, что каждое новое исследование дополняет и изменяет эту «картину мира»

Линия А: A.Br.Vollum (бирюзовый), A.Br.008/009 (красный), A.Br.WNA (синий), A.Br.005/006 (белый), A.Br.003/004 (зелёный), A.Br.Australia-94 (чёрный),

A.Br.001/002 (розовый)

Линия В: B.Br.CNEVA (фиолетовый), B.Br.001/002 (жёлтый) Размеры кругов показывают количественное соотношение исследованных штаммов

Линия В менее разнообразна. Группа B.Br.CNEVA распространена исключительно в континентальной Европе, преимущественно в регионе Альп. Группа B.Br.001/002 распространена в Южной Африке, Европе и Корее. К ней также относятся штаммы, выделенные из вечной мерзлоты (Ямал и Якутия), а также с территории Восточной Сибири и Дальнего Востока (подгруппа Siberia), Южной Кореи (подгруппа Asia). Штаммы производной от неё ветви B.Br.Kruger до 1981 года были широко распространены(1) в северной части Национального парка Крюгер (Kruger National Park), ЮАР, в честь которого и получили своё название. В 2011 году в той же провинции на территории частного заповедника был изолирован штамм от больного гепарда (Acinonyx jubatus)(2), составляющий новую южноафри-

1В период с 1982 по 1997 год выделен только один штамм, после штаммы не выделялись.

2Выделение настоящего штамма стало возможным исключительно благодаря особому охранному статусу гепардов в провинции Лимпопо. И хотя гепарды весьма восприимчивы к токсинам, они хорошо реагируют на вакцинацию, поэтому вполне

57

Раздел I • 4. Штаммы из Кот-д’Ивуара и Камеруна

канскую группу B.Br.011. Ещё одной новой группой стала группа B.Br.009, которую составляет штамм, выделенный от неизвестного хозяина во время вспышки сибирской язвы в Южной Африке в

1939 году.

Линия С включает в себя только группу C.Br.A1055, объединяющую пять штаммов, выделенных в США.

4 ШТАММЫ ИЗ КОТ-Д’ИВУАРА И КАМЕРУНА

Октябрь 2001 года<1>. Национальный парк Таи (Tai National Park), Кот-д’Ивуар. Четверо здоровых западноафриканских шимпанзе (Pan troglodytes verus) из Северного сообщества покинули основную стаю. Три дня спустя в радиусе 50 метров были обнаружены останки троих шимпанзе, а через шесть недель примерно в 200 метрах был обнаружен и скелет четвёртой особи.

Утром 13 февраля 2002 года в Среднем сообществе около спального гнезда был обнаружен труп молодого самца, который накануне выглядел абсолютно здоровым. На следующий день старший самец этого же сообщества внезапно проявил признаки слабости, после чего у него было несколько эпизодов рвоты. В течение двух часов он умер. Ещё один член этой общины пропал в тот же день. Несмотря на интенсивные поиски, он так и не был обнаружен.

Наконец, в июне того же года неполовозрелый самец из Южного сообщества был найден при смерти менее чем через три часа после того, как его видели абсолютно здоровым. Таким образом, во всех трёх сообществах парка были зафиксированы внезапные смертельные исходы у здоровых, обследованных, особей, причём болезнь явно имела фульминантное течение.

вероятно, что из-за сложностей логистики, а также из-за удалённости заповедника от эндемичных территорий данный гепард не был вакцинирован.

1 Leendertz F. H., Ellerbrok H., et al. Anthrax kills wild chimpanzees in a tropical rainforest. Nature. 2004; 430(6998):451–452; DOI: 10.1038/nature02722.

58

Мистерии сибирской язвы

Рис. 4.1. Мозг шимпанзе, поверхностные сосуды которого переполнены кровью; фиксация формалином, на вставке справа мозг до фиксации (по Gräßle T., 2024)

Патологоанатомическое исследование показало наличие геморрагий почти во всех внутренних органах, особенно в кишечнике и лёгких, которые также характеризовались отёком и эмфиземой. Поверхностные сосуды головного мозга были переполнены (Рис. 4.1), что указывает на воспалительное поражение мозговых оболочек (менингит), приведшее к развитию кортикального сидероза (т. е. отложению метаболитов железа в тканях), который визуализируется в виде двухполосной структуры (Рис. 4.2). В тканях селезёнки, печени, лёгких, лимфатических узлов и кишечника были обнаружены грамположительные палочки, которые были отнесены к B. anthracis на основании идентификации генетических маркеров rpoB (хромосома), pag (плазмида рХО1) и capC (плазмида рХО2) при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). При этом вспышек сибирской язвы в этом регионе не регистрировалось, а ДНК сибиреязвенного микроба от шимпанзе ни до, ни после не выделялась. Кроме того, бактерии обнаруживались не только в субарахноидальном пространстве, но и в паренхиме мозга (Рис. 4.3), что не свойственно сибиреязвенному микробу.

59