Мистерии сибирской язвы (учебник)

Раздел I • 2. Мир глазами Коха

следствие, содержание губительного для бактерий азота, тем самым обеспечивая выживание споры. Белок ExsA отвечает за гидрофобность споры и защищает от действия лизоцима (напомним, что белки оболочки также проявляют эту способность)(1). Далее происходит лизис материнской клетки и выход сформированной споры во внешнюю среду, то есть материнская клетка de facto жертвует собой, чтобы обеспечить преспору необходимой «бронёй».

Наверняка самые внимательные уже задаются вопросом: почему, говоря о функции белков, так часто упоминались последствия их отсутствия? Дело в том, что для того, чтобы понять, какой вклад в формирование споры вносит тот или иной белок, следует посмотреть, как формирует спору штамм, у которого выключен ген, ответственный за синтез конкретного белка. И хотя этот метод даёт нам лишь косвенное представление, поскольку белки формируют спору во взаимодействии друг с другом, с его помощью мы можем хотя бы немного приоткрыть завесу этой тайны.

На поверхности экзоспория у некоторых близких родственников сибиреязвенного микроба, в частности B. cereus и B. thuringiensis, могут присутствовать выросты (Enas; от англ. endospore appendages), внешне напоминающие пили грамотрицательных бактерий и состоящие из белков экзоспория. Выросты имеют различную форму (Рис. 2.8) и обладают хорошими адгезивными свойствами за счёт термоустойчивости, нечувствительности к высыханию и химическим повреждениям. Помимо этого, у B. thuringiensis на поверхности спор формируются кристаллические параспоральные тела, в которых заключены инсектицидные Bt-токсины. Обычно они формируются одновременно со спорой внутри материнской клетки, но бывает ситуация, именуемая ассоциацией споры и кри-

сталла (SCA, от англ. spore crystal association), когда тело формиру-

ется внутри экзоспория (Рис. 2.9). Обычно это происходит у штаммов подвида finitimus, имеющих две большие плазмиды, тогда как у штаммов, формирующих параспоральное тело по «классическому» сценарию, плазмида только одна.

1 Более подробно о белках экзоспория можно почитать: Stewart G. G. The exosporium layer of bacterial spores: a connection to the environment and the infected host. Microbiol Mol Biol Rev. 2015; 79(4):437–457; DOI: 10.1128/MMBR.00050–15.

40

Мистерии сибирской язвы

Рис. 2.7. Процесс сборки экзоспория (микрофотографии и схема), где белой стрелкой показан слабый сигнал от белка CotY, а розовой – «колпачки» (красные на схеме); MCР – проксимальный полюс преспоры, MCD – дистальный полюс преспоры, OFM – оболочка преспоры; масштаб 0,5 μm. В верхнем ряду зелёным подсвечены клеточные стенки, а оранжево-красным – белки, формирующие экзоспорий (по Lablaine A., 2021). Посмотрите на эти изображения и снова прочитайте о процессе формирования экзоспория, чтобы лучше понять этот сложный механизм и восхититься им

Рис. 2.8. Споровые выросты:

а – одиночные длинные гибкие у штамма B. cereus 239; b – пучкообразные ветвящиеся у штамма B. cereus 172;

с – трубчатые у штамма B. cereus 19 (по Плиева З. С., 2020)

41

Раздел I • 2. Мир глазами Коха

Рис. 2.9. Схема формирования параспоральных тел и спор (А, слева) и микрофотография (В, слева; ув. 100х) с телом в виде бипирамидального кристалла (стрелка) и спорой (наконечник стрелки). На электронной микрофотографии ультратонкого среза (справа) можно видеть параспоральное тело, формируемое внутри экзоспория (А) и вне него (В). Стрелка указывает на экзоспорий. CW – клеточная стенка, M – мезосома, PM – плазматическая мембрана, AF – аксиальная нить, PC – параспоральное тело (бипирамидальный кристалл), OI – овоидное включение, E – экзоспорий, S – спора (слева по Gonzalez-Vazquez M. C., 2021; спра-

ва по Zhu Y., 2011)

Вышедшая из материнской клетки спора может сохраняться во внешней среде несколько десятилетий и даже столетий. Метаболически она неактивна, а взаимодействие со средой обеспечивают белки оболочки и экзоспория.

С наступлением благоприятных времён спора может «принять решение» о прорастании. Кох пишет: Все попытки развить споры в дистиллированной или колодезной воде при обычной температуре и при 35 °С не увенчались успехом… В конце концов я применил следующий подход, который привёл к цели. На покровное стекло помещали каплю споровых масс, подсушивали и помещали на предметное стекло, на которое заранее наносили чистую водянистую влагу (humor aquosus) бычьей камеры глаза, чтобы она заполнила всё пространство покровного стекла, и споровые массы смачивались этой жидкостью. Не запечатанный маслом препарат помещался во влажную камеру, которую инкубировали при 35 °С… Уже через 3–4 часа стал заметен рост спор (Рис. 2.1- Fig.5). Наиболее развитым он был у края покровного стекла.

42

Мистерии сибирской язвы

Как несложно догадаться, стимуляторами прорастания служат различные химические соединения, в основном питательные вещества, молекулы которых способны пройти сквозь поры экзоспория1, оболочки и связаться с герминальными рецепторами внутреннего слоя коры, а также снижение кислорода воздуха. Далее наступает период так называемой задержки, о котором мы ничего не знаем, кроме того, что он может длиться от нескольких минут до суток (долгопрорастающие споры принято называть сверхспящими). Вполне вероятно, что длительность этого периода зависит от количества герминальных рецепторов. Затем из ядра высвобождаются катионы (преимущественно Н+, К+ и Na+) и наступает этап I, на котором белок SpoVA образует во внутреннем слое коры каналы, через которые из ядра высвобождается значительное количество Ca2+- дипиколиновой кислоты (дипиколиновая кислота в хелате в концентрации 1:1 c Ca2+; CaDPA), совместно с белком внутреннего слоя GerD активирующей белок оболочки CwlJ, который, как говорилось ранее, разрушает кору споры. С этого момента наступает этап II, на котором спора впитывает значительное количество воды (регидратация), благодаря чему внутренний слой набухает, становясь полноценной клеточной стенкой, а в ядре запускаются метаболические процессы. Выход прорастающей споры из экзоспория осуществляется через проксимальный «колпачок», что, вероятно, связано с отсутствием в нём белка Alr (напомним: этот белок ингибирует прорастание).

Вышедшая во внешнюю среду вегетативная клетка имеет клеточную оболочку, состоящую из цитоплазматической мембраны(2), покрытой толстым слоем пептидогликана, поверх которого залегают вторичные полисахариды клеточной стенки (например, липо-

1Следует отметить, что высокое давление (более нескольких тысяч атмосфер) также запускает процесс прорастания, однако такое не встречается в природе.

2Интересно, что мембрана B. anthracis отличается от мембран близкородственных B. cereus и B.thuringiensis тем, что в ней содержится меньше разветвлённых жир-

ных кислот i13:0, a13:0 и i14:0 (см. Kaneda T. Fatty acids in the genus Bacillus I. Isoand anteiso-fatty acids as characteristic constituents of lipids in 10 species. J Bacteriol. 1967; 93(3):894–903; DOI:

10.1128/jb.93.3.894–903.1967). Предлагалось использовать это различие во время вспышек для видовой дифференцировки, однако технические сложности и развитие молекулярно-генетических методов не позволили реализовать эту идею на практике.

43

Раздел I • 2. Мир глазами Коха

тейхоевые кислоты(1)), а за ними – белковый паракристаллический массив, именуемый S-слоем(2) (Рис. 2.10). Всё это покрыто капсулой из поли-γ-D-глутамата (PDGA), которая отсутствует в том случае, если клетка лишена плазмиды рХО2 (о плазмидах сибиреязвенного микроба поговорим далее) или гены на ней не активны.

Клеточная оболочка играет важную роль в жизни бактерии, являясь той границей, которая делает её жизнь возможной. Так, сортазы (т. е. ферменты, модифицирующие белки) мембраны клеточной стенки осуществляют прикрепление белков, обеспечивающих размножение внутри макрофагов (сортаза StrA), поглощение железа (сортаза StrB) и прикрепление некоторых белков, участвующих в споруляции (сортаза StrC). S-слой, по-видимому, играет важную роль в целостности бактерии(3), а располагающийся в нём белок BslO (BSL) катализирует деление клеток. Другой белок, ВА3338, структурно похож на интерналин, способствующий проникнове-

1Ранее считалось, что эти кислоты, свойственные грамположительным бактериям, отсутствуют у B. anthracis, однако недавние исследования показали обратное. Интересно, что отсутствие генов ltaS1 или ltaS2 приводит к неспособности синтезировать липотейхоевые кислоты и, как следствие, к изменению морфологии клеточной оболочки, и снижению эффективности споруляции, и абберативному (т. е.

ненормальному) делению (см. Garufi G., Hendrickx A., et al. Synthesis of lipoteichoic acids in Bacillus anthracis. J Bacteriol. 2012; 194(16):4312–4321; DOI: 10.1128/JB.00626–12).

2Интересно, что этот слой de facto состоит из двух взаимозаменяемых слоёв, существование которых связано с фазой роста бактерии: основным компонентом S- слоя экспоненциальной фазы является поверхностный белок массива (Sap), который постепенно вытесняется экстрагируемым антигеном 1 (ЕА1), являющимся основным компонентом S-слоя стационарной фазы. EA1 неоднороден и имеет большое число разрывов, тогда как Sap более гибок и, таким образом, адаптирован для покрытия быстро делящихся клеток в экспоненциальной фазе. Вместе с тем гены sap и eag, соответственно кодирующие Sap и EA1, могут отсутствовать у ближайших родственников сибиреязвенного микроба. Так, например, они отсутствуют у B. pseudomycoides,

аих присутствие обнаружено лишь у двух штаммов B. thuringiensis (см. Mignot T., Mesnage S. et al. Developmental switch of S-layer protein synthesis in Bacillus anthracis. Mol Microbiol. 2002; 43(6):1615–1627; DOI: 10.1046/j.1365–2958.2002.02852.x; Soufiane B., Sirois M., et al. Mutually exclusive distribution of the sap and eag S-layer genes and the lytB/lytA cell wall hydrolase genes in Bacillus thurin-

giensis. Antonie Van Leeuwenhoek. 2011; 100(3):349–364.; DOI: 10.1007/s10482–011–9590–1).

3 Недавний опыт по деполимеризации S-слоя продемонстрировал быстрое разрушение клеток в отличие от клеток, не способных синтезировать белок Sap S-слоя,

поскольку, по-видимому, белок ЕА1 таких клеток способен устранять дефекты (см.

Chateau A., der Verren S. E., et al. The Bacillus anthracis cell envelope: composition, physiological role, and clinical relevance. Microorganisms. 2020; 8(12):1864; DOI: 10.3390/microorganisms8121864). Интересно,

что Sap также является мишенью для бактериофагов, а ЕА1 присутствует в оболочке спор, хотя его функции неизвестны.

44

Мистерии сибирской язвы

Рис. 2.10. Организация клеточной оболочки B. anthracis; электронная микрофотография тонкого среза с негативным окрашиванием (А) и схематическое изображение организации (В), где для удобства понимания капсула показана только в правой части: М – мембрана, PG – пептидогликан, SCWP – вторичные полисахариды клеточной стенки (по Chateau A., 2020)

нию бактерии в клетки млекопитающего, а уже знакомый нам белок BslA (напомним: он входит в состав ворсинок экзоспония), синтез которого кодируется плазмидой рХО1, обеспечивает прикрепление к ним. Наконец капсула, синтез которой происходит в ответ на сигналы окружающей среды, такие как колебания концентрации СО2 и бикарбоната, подобно плащу-невидимке скрывает поверхностные антигены бактерии от иммунной системы.

45

Раздел I • 3. Внутренний мир и эволюция

3 ВНУТРЕННИЙ МИР И ЭВОЛЮЦИЯ

Считается, что возбудитель сибирской язвы, бактерия B. anthracis, возник относительно недавно, примерно 10 000 лет назад. Это крупная грамположительная неподвижная палочка, существующая в трёх формах – капсульной и бескапсульной вегетативной, а также споровой. Вегетативные формы имеют размер 1– 1,5 х 6–10 мкм, концы слегка закруглены или как бы обрублены и слегка вогнуты. Споры имеют размер 0,8–1,0 х 1,2–1,5 мкм. Геном состоит из кольцевой хромосомы и двух внехромосомных элементов – плазмид вирулентности, приобретение которых стало главным эволюционным событием, выделившим сибиреязвенный микроб в качестве самостоятельного вида.

Плазмида рХО1 была открыта в 1983 году<1> двумя исследовательскими группами, искавшими генетическую детерминанту, ответственную за продукцию бактерией токсинов, открытых ещё в начале 1950-х годов<2>. Выделенная ими плазмида размером 181–182 Кб получила название pBA1 (Рис. 3.1), однако позже с целью унификации названия со второй плазмидой была переименована в pXO1. На этой плазмиде расположено 134 открытых рамки считывания (ORF, от англ. Open Reading Frame), то есть 134 области, потенциально способных кодировать синтез 134 белков. Функции большинства из них неизвестны, но некоторые ORF кодируют белки, схожие с белками других микроорганизмов, поэтому мы можем предполагать<3> их функции. Так, ORF 07 кодирует белок, на 56 % сходный с обратной транскриптазой Escherichia coli; ORF 13 – на 43 % сходный с белком инвазии Plasmodium yoelii; ORF 18 – на 46 %

1 Mikesell P., Ivins B. E., et al. Evidence for plasmid-mediated toxin production in Bacillus anthracis. Infect

Immun. 1983; 39(1):371–376; DOI: 10.1128/iai.39.1.371–376.1983; Robillard N. J., Koehler T. M., et al. Plasmid pBAI-mediated toxin production in Bacillus anthracis cells. Abstr. Annu Meet Amer Soc Microbiol. 1983; H54:115.

2Smith H., Keppie J. Observations on experimental Anthrax: demonstration of a specific lethal factor produced in vivo by Bacillus anthracis. Nature. 1954; 173:869–870; DOI: 10.1038/173869a0; Smith H., Keppie J. et al. The chemical basis of the virulence of Bacillus anthracis. V. The specific toxin produced by B. anthracis in vivo. Br J Exp Pathol. 1955; 36:460–472.

3Okinaka R. T., Cloud K., et al. Sequence and organization of pXO1, the large Bacillus anthracis plasmid harboring the anthrax toxin genes. J Bacteriol. 1999; 181(20):6509–6515; DOI: 10.1128/jb.181.20.6509– 6515.1999

46

Мистерии сибирской язвы

Рис. 3.1. Микрофотография плазмиды рВА1 (сейчас рХО1) массой 114 МДа, выделенной из штамма B. anthracis Vollum 1B. В правом верхнем углу приведена стандартная ДНК φХ174 массой 3,558 МДа (по Mikesell P., 1983; публикуется по лицензии the American Society for Microbiology; разрешение передано через the Copyright Clearance Center, Inc.)

сходный с белком интегразы Methanothermobacter thermautotrophicus; ORF 59 – на 53 % сходный с секреторной протеинкиназой Chlorobium limicola; а ORF 115 – на 67 % сходный с резолвазой Enterococcus faecium. Примечательно, что большинство микроорганизмов являются грамотрицательными бактериями, однако наибольшее сходство обнаружено, конечно же, с белками близких родственников: кодируемые ORF 35, 36 и 39 белки сходны с транспозазами B. thuringiensis на 95, 74 и 94 % соответственно.

Наибольший интерес представляет зона, ограниченная с двух сторон почти идентичными IS1627-элементами, которую принято называть остров патогенности. Предполагается, что он содержит в общей сложности тридцать одну ORF. На нём располагаются гены сибиреязвенного токсина:

ген pagA (ORF 110), кодирующий протективный антиген

(РА, от англ. protective antigen), представляющий собой порообразующий белок;

47

Раздел I • 3. Внутренний мир и эволюция

ген lef (ORF 107), кодирующий летальный фактор (LF, от англ. lethal factor), представляющий собой цинк-зависимую металлопротеазу, специфичную в отношении митогенактивируемых киназ клетки млекопитающего, расщепляя которые, она нарушает сигнальные пути этих клеток;

ген cya (ORF 122), кодирующий отёчный фактор (EF, от англ. edema factor), представляющий кальмодулинзависимую аденилатциклазу, которая за счёт увеличения уровня синтеза циклического аденозинмонофосфата также нарушает сигнальные пути клетки млекопитающего1;

а также их регуляторные гены atxA (ORF 119) и pagR (ORF 109).

На этом моменте лучше положить закладку или даже выписать названия генов и синтез каких белков они кодируют, поскольку с первого раза эта информация не запомнится, но понадобится в дальнейшем.

Идём далее. Протективный антиген связывается со специфическими клеточными рецепторами – белками, синтезированными на поверхности клетки восприимчивого млекопитающего. В качестве таких белков выступают рецепторы сибиреязвенного токсина ANTRX1 и ANTRX2, также, соответственно, известные как маркер эндотелия опухоли – 8 (TEM-8) и белок морфогенеза капилляров – 2 (CMG-2), а также белок 6, связанный с рецептором липопротеинов низкой плотности (LRP6), и интегрин β1, хотя связывание с ними происходит в меньшей степени. Далее, под действием клеточноассоциированной протеолитической активности фурина, протективный антиген (РА83) расщепляется на РА20 и РА63. При этом отщепление РА20 способствует самоорганизации РА63 в кольцеобразный гептамер (препору)( 2 ) и открывает на нём гидрофобную поверхность, что обеспечивает связывание с летальным и отёчным факторами, то есть образование летального токсина (LT, от англ. lethal toxin) и отёчного токсина (ET, от англ. edema toxin), состоя-

1Клиническое действие фактора проявляется в виде отёка тканей, что и стало основанием для его названия.

2Также формируется октамерная структура, которая более рН-стабильна, чем

гептамерная, и может сохраняться в плазме, однако её роль всё ещё не ясна (см.

Kintzer A. F., Thoren K. L., et al. The protective antigen component of anthrax toxin forms functional octameric complexes. J Mol Biol. 2009; 392(3):614–629; DOI: 10.1016/j.jmb.2009.07.037).

48

Мистерии сибирской язвы

щих из субъединицы А (LF или EF) и субъединицы В (РА). Они, в свою очередь, перемещаются в эндосомы, где высокая концентрация протонов (низкие значения рН) способствует формированию поры, которая вставляется в эндосомальную мембрану, образуя канал. Через этот канал летальный и отёчный факторы транслоцируются в цитозоль клетки. Интересно, что просвет поры (диаметр канала в поперечном разрезе) очень мал и значительно уже́ диаметра транслоцируемых белковых структур. Так как же они туда протискиваются? Дело в том, что низкий рН влияет не только на РА63, но и на прикреплённые к нему летальный и отёчный факторы, которые под его действием становятся неупорядоченными расплавленными глобулами. Это такое состояние белка, при котором он как бы слегка денатурируется (развёртывается) и переходит в структуру между третичной и вторичной, то есть лишается плотной упаковки боковых цепей. В таком виде он компактный (глобула) и за счёт градиента рН между эндосомой и цитозолем быстро втягивается («вплывает») в цитозоль цитоплазмы.

Происходит это следующим образом (Рис. 3.2). Белок (фактор) связывается с ободком воронки поры и, разворачиваясь, направляется вниз по сужающейся структуре к каналу поры, именуемому β- ствол. Тут он встречает α-зажим, который связывает спиральные части белка, располагая их по направлению к просвету β-ствола. Далее он проходит Ф-зажим, представляющий собой кольцевую структуру в 6 Å (0,6 нм), поддерживающую градиент рН. Чтобы пройти через столь узкое кольцо, белок полностью разворачивается и потом снова сворачивается. Продвигаясь по β-стволу, он взаимодействует с зажимами заряда, которые обеспечивают направление его движения. Попав в цитозоль, токсин распадается на две субъединицы (летальный и отёчный факторы), которые нарушают сигнальные пути клетки, что приводит к её гибели.

Невольно напрашивается вопрос: зачем нужен настолько сложный механизм? Скорее всего именно он обеспечивает наиболее быстрое прохождение белка в клетку, поскольку очевидно, что для этого ему необходимо развернуться, а последовательное прохождение зажимов позволяет в каждый момент времени иметь раскрученным лишь небольшой участок. Этот процесс можно сравнить с перематыванием плёнки с одной бобины на другую: задача значи-

49